食管鱗癌組織中TRIM28和p16的表達與臨床病理因素的關系

孫微 劉博 李秀娟 李坤 林媛媛 呂洋 李鳳玉

河北北方學院 1組織學與胚胎學教研室，3病理教研室（河北張家口 075000）；2河北北方學院附屬第一醫院病理科（河北張家口 075000）；4解放軍251醫院腫瘤科（河北張家口 075000）

近年來，腫瘤已成為危害人類生命的頭號殺手，所有腫瘤中病死率位居第6位的是食管癌，其5年生存率 ＜20%［1］，其中食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為最常見的組織分型［2］。目前，醫者對于腫瘤的治療主要著眼于手術及術后放、化療，在治療方式上已取得較大突破，但患者的總生存期改善效果不佳，大部分ESCC患者確診時已到晚期，且預后較差易轉移或復發，因此盡早找到治療ESCC的關鍵靶點迫在眉睫。三結構域蛋白家族（tripartite motif，TRIM）是近年發現的影響腫瘤細胞生長、侵襲、遷移的重要調控家族，其中該家族成員TRIM28是腫瘤發展中主要的調節因子［3］。TRIM28可使細胞本身對DNA損傷的敏感性增強，進而阻止凋亡發生并調控細胞節律周期，研究表明TRIM28在宮頸癌、結直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等多種癌癥中均高表達，且與患者的不良預后相關［3］。但目前國內外尚未見TRIM28基因在食管癌中生物學作用的相關報道。p16基因又叫做多腫瘤抑制基因1（multiple tumor suppressor 1，MTS1），是一種直接參與細胞周期節律性調控的新型抑癌基因，其負性調節細胞的分裂衍生，p16基因缺失、突變將直接導致腫瘤細胞惡性生長［4］。研究［5］發現 p16基因在卵巢癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌等多種腫瘤中低表達，且與患者病理特征相關。本研究通過免疫組織化學染色及免疫熒光染色技術，對136例ESCC患者腫瘤組織及37例距腫瘤邊緣5 cm以上的正常食管黏膜組織中的TRIM28和p16進行檢測，觀察ESCC中TRIM28和p16的表達情況及與臨床病理特征的相關性，從而為食管癌的早期發現、早期診斷、早期治療提供新的實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究應用隨機的方式，收取2008年1月1日至2009年12月31日間河北北方學院附屬第一醫院136例原發性ESCC患者手術切除的組織標本，同時選取37例距癌組織邊緣5 cm以上的正常食管黏膜組織作為對照，經病理證實對照標本均未見癌細胞浸潤、細胞增生、炎癥等病變。136例原發性ESCC患者的臨床及隨訪資料均齊全，且在術前均未接受過其他治療，年齡27～80歲（中位年齡61歲），其中女45例，男91例。每一病例選擇相同的蠟塊取4 μm厚連續切片備用。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑兔抗人TRIM28多克隆抗體、鼠抗人p16多克隆抗體（America?Gene Tex公司）；枸櫞酸緩沖液、DAB顯色劑、PBS緩沖液、S?P免疫組化試劑盒（China?北京夢怡美生物科技公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）標記山羊抗鼠IgG（America?Santa Cruz公司）；TritionX?100、DAPI顯色劑、抗體稀釋液（China?北京依諾凱生物科技公司）。

1.2.2 免疫組織化學染色將標本切片脫蠟水化，高壓加熱法進行抗原修復10～15 min，隨后滴加內源性阻斷劑阻斷8 min；加入一抗使其將組織完全覆蓋（對照組織一抗用PBS代替，結果為陰性），4℃過夜后取出復溫25 min，PBS浸洗3次，嚴格按照試劑盒說明書順序依次滴加二抗等試劑；接著加入室溫下已配制的新鮮二氨基聯苯胺液（DAB液），顯色5 min；最后依次復染、脫水、封片固定。

結果判定：由兩位病理科主任醫師在雙盲的條件下評判全部免疫組化染色結果，并進行圖像采集；TRIM28和p16蛋白的陽性信號均主要定位于細胞核，胞核呈現染色一致的棕黃色顆粒或絲狀物判為陽性。權衡陽性細胞占觀察細胞的百分比大小及著色效果的強弱對染色結果進行判定：遵循隨機化的原則，選取5個高倍鏡視野分別計算每個視野下陽性細胞所占百分比并得出平均數，依陽性細胞數量所占百分比大小評為0～3分，陽性細胞＜10%評為0分，10%～49%評為1分，50%～74%評為2分，≥75%為3分；同理著色強弱也評為0～3分，無色評為0分，灰黃色評為1分，金黃色評為2分，棕黃色評為3分；最終將兩項評定標準所得分數相加按總分進行陰陽分級：0～2分評為陰性，≥3分評為陽性。

1.2.3 免疫熒光染色向已脫蠟至水的組織標本滴加1%TritionX?100進行破膜，隨后用枸櫞酸緩沖液抗原修復15 min，加入封閉液，用濾紙輕柔吸去組織表面封閉液，滴加一抗并覆蓋全部組織；4℃過夜后取出避光復溫25 min，以下操作均在暗室內進行，PBS浸洗3次，滴加FITC標記的熒光二抗，隨后在37℃的條件下避光溫育45 min；加入新鮮配制的DAPI染色劑，室溫孵育15 min進行染色；最后PBS漂洗3次后封片，于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。

結果判定：在激光共聚焦顯微鏡下對圖像進行采集，呈陽性表達的細胞可見胞核部位顯現為黃綠色熒光（FITC），呈點狀分布；而陰性表達細胞的胞核可以被DAPI復染而顯現為藍色熒光，且整體背景清晰無其他著色。

1.4 統計學方法所有資料數據結果均通過SPSS 17.0統計軟件加工處理。TRIM28及p16蛋白在ESCC組織中表達的特征與患者臨床病理表現的關系、兩種蛋白在正常食管黏膜組織及ESCC組織中表達量差異均用χ2檢驗分析處理；采用Spearman等級相關分析處理TRIM28及p16蛋白在ESCC組織中表達相關性。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TRIM28及p16在兩種組織中的表達情況蛋白表達結果顯示，TRIM28的陽性率在ESCC組織（91.2%）高于正常食管黏膜組織（24%），而p16的陽性率在ESCC組織（32.4%）則低于食管黏膜組織（57%），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖1、2及表1。

圖1 TRIM28及P16在136例ESCC中的表達情況（SP×200）Fig.1 The expression of TRIM28 and P16 in 136 cases of ESCC（SP × 200）

2.2 TRIM28及p16的表達與患者臨床病理特征的關系TRIM28及p16在ESCC的異常表達均與患者腫瘤的浸潤深度、TNM分期、有無淋巴結轉移相關（均P＜0.05）。具有高TNM分期、伴有淋巴結轉移表現且浸潤程度侵及全層的ESCC患者，其腫瘤組織中的TRIM28表達較強而p16表達較弱。見表2。

圖2 TRIM28及P16在37例正常食管黏膜中的表達情況（SP×200）Fig.2 The expression of TRIM28 and P16 in 37 cases of normal esophageal mucosa（SP × 200）

表1 TRIM28及p16在ESCC和正常食管黏膜組織中的表達情況Tab.1 The expression of TRIM28 and p16 in ESCC and normal esophageal mucosa 例

表2 TRIM28及p16的表達與ESCC患者病理情況的關系Tab.2 The expression of TRIM28，p16 and their relation to clincopathologic factors in esophageal carcinoma 例

2.3 免疫熒光染色結果激光共聚焦顯微鏡下觀察TRIM28及p16二者陽性信號在ESCC組織中的定位表達情況。結果發現，二者在ESCC組織中均定位于胞核。見圖3。

圖3 TRIM28及p16在136例ESCC中的定位情況Fig.3 The location of TRIM28 and p16 in 136 cases of ESCC

2.4 TRIM28及p16在ESCC中表達的相互關系TRIM28與p16在ESCC組織中的表達呈負相關（r=-0.284）。TRIM28在p16陽性組中的表達率（79.5%）低于其在p16陰性組中的表達率（96.7%），差異具有統計學意義（P=0.001）。

3 討論

ESCC形成及惡化的生物學過程極為復雜，在諸多生理病理因素的影響下其病死率及術后復發率逐年攀升，而致其復發的根基在于癌細胞的侵襲遷移。在多種基因參與及多個生物化學反應發生的條件下癌細胞才能在其宿主體內順利完成遷移，目前，研究發現，原癌基因激活及抑癌基因失活的動態平衡失調將直接主導癌細胞的轉移［6］。HATAKEYAMA［7］發現TRIM家族的多位成員均以原癌或抑癌基因的身份作用于腫瘤細胞從而參與腫瘤生長的生物過程。TRIM28也被稱為TIF1β或KAP1，有研究報道，TRIM28是調節人類機能的樞紐站，其可在DNA損傷反應、免疫反應、腫瘤反應、病毒復制、細胞分裂分化等生物學進程中展現調節功能，例如TRIM28可通過修復DNA損傷反應從而加速腫瘤細胞周期，行使類似原癌基因的功能促進腫瘤生長進展［8］。TRIM28不僅是一個穩定的表觀遺傳基因，更是一個無處不在的過表達基因，其多種生物學功能及作用機制的相關研究是在癌癥研究基礎上進行的。ADDISON等［9］在細胞實驗研究中觀察到，乳腺癌細胞系中的TRIM28基因表達過高且其高表達有助于癌細胞尋找新的腫瘤微環境發生遷移。LIU等［10］通過克隆形成實驗、RNA干擾技術等研究表明在非小細胞肺癌組織中TRIM28基因表達上調，且當TRIM28基因表達被siRNA阻斷后，肺腺癌細胞生長受到抑制。FITZGERALD等［11］采用細胞及臨床實驗相結合的方式對TRIM28在結直腸癌組織中的表達情況進行研究，結果發現其在結直腸癌中高表達，并可通過降低其表達的方式，實現對結直腸癌細胞衍生及遷移的控制。但目前國內外罕見TRIM28基因在食管癌中表達情況的相關報道。本研究為回顧性研究，主要通過免疫組化技術檢測TRIM28在136例ESCC組織中的表達情況，結果發現TRIM28在食管癌的進程中扮演促癌基因的角色，其陽性表達率高達91.2%，與之相比其在正常食管黏膜組織中的陽性率僅為24%，差異有統計學意義（P＜0.05）。本研究還發現TRIM28表達程度越高ESCC患者的TNM分期也越高，且多伴有腫瘤浸潤深達全層及淋巴結轉移的發生，表明TRIM28與ESCC的惡性進程相關。本研究結果顯示在ESCC中TRIM28表達水平顯著上升，且其高表達與患者腫瘤轉移惡化相關，這與上述前人研究其在宮頸癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌等腫瘤中表達上調的趨勢基本一致，再次驗證了TRIM28與腫瘤侵襲遷移的相關性，為尋找攻破腫瘤的作用靶點開辟新路徑。

p16基因位于人染色體9p21上，最常見的抑癌基因之一，包含2個內含子及3個外顯子［12］。腫瘤方面的相關實驗研究表明，癌細胞株中p16基因發生突變或缺失，均促使p16蛋白合成受阻，從而造成細胞失控性增殖促進腫瘤衍生［13］。p16蛋白是介導細胞周期節律調控的基因表達產物，是搭建各種腫瘤衍生和細胞節律異常之間的橋梁物質之一。史恩溢等［14］研究發現p16基因在胃腸間質瘤組織中表達明顯下調，且其表達隨腫瘤的衍生惡化而降低。NA等［15］探究p16蛋白在卵巢腫瘤中的表達情況時發現，腫瘤組織中p16的表達強度明顯低于正常卵巢組織，另外，存在淋巴結轉移患者較無轉移患者的p16蛋白表達強度更低。本研究結果顯示，p16的陽性率在ESCC組織低于食管黏膜組織，且其表達與ESCC患者的TNM分期、有無淋巴結轉移、浸潤程度等相關，在TNM分期較高、有淋巴結轉移且腫瘤浸潤程度較深的患者組織標本中檢測到p16表達強度均較弱，此結果與DEY等［16］的研究結果相一致。

本研究結果還顯示：TRIM28與p16在ESCC組織中的表達呈負相關。p16在TRIM28陽性患者組織標本中的表達率低于其在TRIM28陰性患者組織標本中的表達率；此外，它們在ESCC組織中的定位將直接關系到其功能的執行情況，本研究發現二者的陽性信號均定位于胞核，它們通過介導癌細胞周期節律紊亂，加速細胞周期促使癌細胞失控性增殖，進而參與腫瘤衍生進程。在此進程中，p16基因執行抑癌功能的命令被阻斷，而TRIM28基因通過修復DNA損傷反應加速腫瘤細胞周期，它們相互作用、相互影響，促進腫瘤細胞生長發揮類似原癌基因的功能，但具體機制還未研究清楚需進一步研究探討。

綜上所述，筆者認為TRIM28與p16參與調控ESCC的發生及惡化，同時二者表達情況還與ESCC患者的TNM分期、有無淋巴結轉移、浸潤程度等病理特征相關，有可能成為ESCC靶向生物治療的重要靶點，并輔助ESCC早期診斷、臨床治療及患者預后評估，為攻破ESCC提供新思路、新依據。

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