丙烯酰胺母源性暴露對仔鼠海馬齒狀回DCX和GAP?43表達的影響

楊德慧 賴勝敏 古梓婷 劉鴻慶 馬宇昕 羅利 李國營 劉靖

廣東藥科大學基礎學院人體解剖學教研室（廣州 510006）

丙烯酰胺（acrylamide，ACR）是一種可溶于水的乙烯基單體，其復合體聚丙烯酰胺廣泛應用于化工行業［1］。業已證實ACR對人和動物具有神經毒性，能夠選擇性地損害中樞神經和周圍神經的神經元終末，出現共濟失調、肢體乏力、四肢麻木、感覺障礙等一系列臨床癥狀［2］。然而關于ACR神經發育毒性報道較少，胎兒和嬰兒正處于神經系統發育重要階段，特別是血腦屏障尚未發育成熟，可能更容易受到各種有害因素的損傷，特別是神經毒物。在中樞神經系統發育過程中，雙皮質素（doublecortin，DCX）和生長相關蛋白?43（growth associated protein?34，GAP?43）共同參與了神經元生成和發育的全過程。其中，DCX是一種微管相關蛋白，在神經元分化和遷移過程中階段性地表達于神經元的突起和胞體上，其陽性細胞的數量可以反映海馬齒狀回新生神經元的增殖情況［3］。另外，GAP?43是一種促進神經元修復與合成的胞膜上的特異性磷酸蛋白，能夠促進神經元軸突的延伸［4］。

因此，本實驗通過建立ACR母源性暴露，檢測仔鼠海馬齒狀回DCX和GAP?43的表達情況進行探討ACR對神經元的生長發育的影響，為研究ACR的神經發育毒性提供理論和實驗依據，有利于優生優育。

1 材料與方法

1.1 主要試劑ACR（美國Sigma公司，純度99.9%）、Rabbit Anti?DCX（美國 Abcam 公司）、Rabbit Anti?GAP?34（武漢博士德生物公司）、HRP標記山羊抗兔（美國Ear thox公司）。

1.2 實驗動物6周齡級SD大鼠由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（粵）2013?0002。雌鼠32只，雄鼠16只，體質量140～160 g，所有實驗動物在SPF級的條件下自由攝食和飲水，雌鼠懷孕后單籠飼養。

1.3 動物分組及染毒SD大鼠體成熟后，雌雄以1∶1進行交配，孕鼠隨機分為4組，分別為對照組（0 mg/kg）、低（4.5 mg/kg）、中（9 mg/kg）和高（18 mg/kg）劑量組，每組8只。于母鼠妊娠第15天開始灌胃給藥，連續給藥至分娩后第13天，分娩后第14天，對仔鼠進行取材。

1.4 動物取材仔鼠出生后第14天，在4%水合氯醛腹腔注射麻醉下，以0.9%生理鹽水沖洗和4%多聚甲醛溶液灌注，灌注固定后取腦置于4%多聚甲醛中固定48 h，組織常規脫水和石蠟包埋，用于免疫組織化學檢測。

1.5 免疫組織化學檢測切片常規脫蠟至水，在0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸緩沖液中微波修復20 min，3%H2O2?PBS室溫處理30 min，5%BSA封閉液37℃封閉30 min，于4℃冰箱孵育一抗過夜。次日滴加HRP標記的二抗在37℃孵育40 min。DAB顯色4.5 min，切片置于ddH2O終止顯色。蘇木素染色15 s，自來水返藍2 min。切片繼續脫水后用中性樹脂封片。封片后選取每組每只大鼠2張切片，隨機選取3個視野，用Image pro?plus 6.0圖像分析軟件計算免疫陽性表達物積分光密度值（IOD）。

1.6 統計學方法利用Image pro?plus 6.0圖像分析軟件進行光密度值分析，陽性表達物的平均光密度值，以表示，結果采用統計軟件SPSS 17.0進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ACR對P14仔鼠海馬齒狀回GAP?43表達的影響 見圖1，GAP?43陽性表達物為黃棕色物質，環繞細胞核分布，呈中空狀。GAP?43能夠調節軸突的生長，是神經元發育過程中的標志位之一。與對照組和低劑量組相比較，中、高劑量組仔鼠海馬齒狀回GAP?43均明顯有減少（P＜0.01）。見圖2。

圖1 各實驗組仔鼠海馬GAP?43的表達情況（IHC×400）Fig.1 Effect of ACR on expression of GFAP in the hippocampal mother rats

表1 ACR染毒對仔鼠海馬齒狀回GAP?43表達的影響Tab.1 Effect of ACR on expression of GAP?43 in the hippocampal dentate of offsprings（n=8） x± s

2.2 ACR對P14仔鼠海馬齒狀回DCX表達的影響本實驗通過免疫組織化學方法檢測P14仔鼠海馬齒狀回中DCX的陽性表達來檢測神經元突起形成的情況。與對照組相比較，ACR中、高劑量組仔鼠海馬齒狀回DCX的陽性表達物均顯著減少（P＜0.01）。

3 討論

圖2 各實驗組仔鼠海馬DCX的表達情況（IHC×400）Fig.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal mother rats

表2 ACR染毒對仔鼠海馬齒狀回DCX表達的影響Tab.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal dentate of offsprings（n=8）±s

表2 ACR染毒對仔鼠海馬齒狀回DCX表達的影響Tab.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal dentate of offsprings（n=8）±s

注：與對照組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組IOD of DCX 9.37±0.70 7.75±0.39 6.21±0.33*4.43±0.56**

ACR是生產聚丙烯酰胺的原材料，廣泛應用于各行業。動物實驗業已證實ACR具有多種毒性，并在人體發現其神經毒性。ACR可以通過多種途徑進行傳播，胎盤和哺乳亦是ACR傳播的方式［1］。ACR的神經毒性具有累積性，低劑量長期染毒和高劑量短期染毒均可導致明顯的神經毒性［5］。ACR母源性暴露后，胎兒和嬰兒的健康與安全受到威脅［6］。海馬屬于邊緣系統的一部分，不但與學習、記憶、情緒等相關，其中齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）更是神經發生和神經再生的重要部位之一。神經干細胞位于海馬門區與顆粒細胞層之間的顆粒下層，新生成的神經元從顆粒下層移入顆粒層，接受突觸傳入沖動，把軸突伸進苔狀纖維通路，整合到海馬功能的神經環路中，參與海馬的學習記憶等功能活動［7］。有研究顯示，母鼠通過飲水攝入ACR后，仔鼠海馬齒狀回Reelin免疫反應細胞和谷氨酸脫羧酶67免疫反應細胞呈劑量依賴性的增加，ACR干擾了海馬齒狀回神經元的遷移和定位［8］。而在中樞神經系統的發育過程中，神經元所分泌的蛋白GAP?43和DCX共同參與調節神經元的生長與發育。因此，我們通過檢測仔鼠海馬GAP?43和DCX表達情況，研究ACR對神經元發育的影響。

在本研究中，ACR暴露后，與對照組相比較，中、高劑量組仔鼠海馬齒狀回GAP?43的表達明顯下降。GAP?43是一種磷酸蛋白，特異性地表達于神經元胞膜上，調節軸突的生長、突觸的形成和神經遞質的釋放［9-10］。在神經元發育過程中，GAP?43引導軸突生長和調節突觸聯系中發揮著重要作用［9］。GAP?43表達的含量與軸突的生長、突觸的塑造狀態相一致［11］。在神經系統發育過程中，GAP?43有較高的表達，被認為是神經元發育和再生的一個內在決定因子，能夠促進神經元軸突的生長［12］。GAP?43的減少將降低軸突結構的可塑性，包括軸突與樹突的發芽，其表達與神經元軸突和樹突的功能呈正相關［13?14］。由此筆者推測，GAP?43表達減少后，神經元軸突和樹突的發育受到了抑制。另外，本研究通過免疫組織化學法檢測發現，ACR暴露后仔鼠海馬齒狀回DCX亦顯著表達減少。DCX是一種微管相關蛋白，在神經元分化、遷移過程中階段性地表達于神經元周圍的突起和胞體上，參與神經元突起的形成與發育［3］。DCX可促進微管聚合并穩定其網絡結構，在神經元遷移過程中控制著神經元的聚合，穩定細胞骨架［15］。DCX表達下降，提示ACR母源性暴露可能導致仔鼠海馬神經發生、分化受到抑制。有實驗報道，把ACR注射到小鼠體內后，能夠抑制其海馬齒狀回增殖活性，新生神經元減少［16］。ACR母源性暴露后，仔鼠海馬齒狀回GAP?43和DCX的表達均下降，提示ACR可能影響海馬神經元的增殖、分化以及神經元軸突的延伸。ACR的神經發育毒性作用可能是多因素的，其作用機制尚有待進一步研究。

綜上所述，母源性暴露后ACR能夠減少仔鼠大腦GAP?43和DCX的表達，可能抑制了海馬神經元的生長發育。而海馬區與學習、記憶等高級功能密切相關，ACR母源性暴露后可能會影響到仔鼠空間學習和記憶能力發展［17］。

［1］ERKEKOGLU P，BAYDAR T.Acrylamide neurotoxicity［J］.Nutr Neurosci，2014，17（2）：49?57.

［2］LOPACHIN R M，GAVIN T.Acrylamide?induced nerve termi?nal damage：relevance to neurotoxic and neurodegenerative mechanisms［J］.J Agric Food Chem，2008，56（15）：5994?6003.

［3］FRANCIS F，KOULAKOOF A，BOUCHER D，et al.Double?cortin is a developmentally regulated，microtubule?associated protein expressed in migrating and differentiating neurons［J］.Neuron，1999，23：247?256.

［4］陳慶友，師巖，王中華.丁苯酞改善血管性癡呆大鼠認知功能及其對海馬區GAP?43和突觸素表達的影響［J］.中國老年學雜志，2016（8）：1830?1831.

［5］LOPACHIN R M.Acrylamide neurotoxicity： neurological，morhological and molecular endpoints in animal models［J］.Adv Exp Med Biol，2005，561：21?37.

［6］FRIEDMAN M A，TYL R W，MARR M C，et al.Effects of lac?tational administration of acrylamide on rat dams and offspring［J］.Reprod Toxicol，1999，13（6）：511?520.

［7］ZHAO C，DENG W，GAGE F H.Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis［J］.Cell，2008，132（4）：645?660.

［8］OGAWA B，OHISHI T，WANG L，et al.Disruptive neuronal development by acrylamide in the hippocampal dentate hilus af?ter developmental exposure in rats［J］.Arch Toxicol，2011 ，85（8）：987?994.

［9］DONNEIIL C J，PARK M，SPILLANE M，et al.Axonally syn?thesized β?actin and GAP?43 proteins support distinct modes of axonal growth［J］.J Neurosci，2013，33（8）：3311?3322.

［10］MUTTUCUMARU N，POWERS S J，ELMORE J S，et al.Acrylamide?forming potential of potatoes grown at different loca?tions，and the ratio of free asparagine to reducing sugars at which free asparagine becomes a limiting factor for acrylamide?formation［J］.Food Chem，2017，220：76?86.

［11］GUPTA S K，MISHRA R，KUSUM S，et al.GAP?43 is essen?tial for the neurotrophic effects of BDNF and positive AMPA re?ceptor modulator S18986［J］.Cell Death Differ，2009，16（4）：624?637.

［12］張征宇，袁寶莉，鄧素娟.1，6?二磷酸果糖對腦白質損害大鼠皮質生長相關蛋白43表達的影響［J］.實用醫學雜志，2011，27（13）：2330?2333.

［13］CHEN M Y，WANG E H，WOODSON W J，et al.Optogenetic neuronal stimulation promotes functional recovery after stroke［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（35）：12913?12918.

［14］SHAH A M，ISHIZAKA S，CHENG M Y，et al.Optogenetic neuronal stimulation of the lateral cerebellar nucleus promotes persistent functional recovery after stroke［J］.Sci Rep，2017，7：46612.

［15］MERZ K，LIE D C.Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice［J］.PLoS One，2013，8（5）：e62693.

［16］PARK H R，KIM M S，KIM S J，et al.Acrylamide induces cell death in neural progenitor cells and impairs hippocampal neurogenesis［J］.Toxicol Lett，2010，193（1）：86?93.

［17］劉富，兵尹力，朱宇航，等.異氟醚對老年大鼠學習記憶能力及海馬NMDAR1表達的影響［J］.實用醫學雜志，2016，32（1）：34?37.