敲低及過表達G6PD對肝癌細胞增殖和遷移的影響

馮笑 劉兆宇 胡臘 陳紀濤 曾子成 劉季芳

廣州醫科大學附屬第五醫院（廣州510710）

自 1956 年 WARBURG［1］提出腫瘤細胞中的Warburg現象以來，迄今已有許多研究證明在腫瘤中存在多種代謝途徑的變化，代謝改變已被歸納為腫瘤的特征之一［2］。有研究證明，致瘤性損傷能夠誘導葡萄糖流量進入磷酸戊糖途徑（PPP）［3］，腫瘤中PPP的改變是腫瘤代謝特征的重要部分。而6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）作為PPP的關鍵酶，控制著經PPP的糖流量，對PPP的研究重點在于對G6PD的研究。

G6PD的基因位于Xq28.1，長18 kd，含13個外顯子和12個內含子，近年研究表明，G6PD的表達與腫瘤存在密切關聯，其在胃癌［4］、黑色素瘤［5］、膀胱癌［6］、腎透明細胞癌［7］多種腫瘤組織標本中表達量上升，在胃癌［4］、食管鱗癌［8］、乳腺癌［9］中 G6PD的表達量與腫瘤患者的臨床預后及生存期呈負性相關，也有研究發現G6PD可通過促進血管生成促進腫瘤生長［10］。G6PD如今被視為一種與臨床預后相關的癌基因及腫瘤標志物，在腫瘤的生存、增殖、轉移中都發揮著重要作用。原發性肝癌作為一種常見癌癥，與機體的糖代謝異常存在相關性［11］，用于治療代謝性疾病糖尿病的二甲雙胍能夠改變肝癌細胞的線粒體形態及功能［12］，這提示肝癌細胞中的代謝也存在異常。過往對肝癌中G6PD基因的研究較少，有研究證實在HBV相關肝癌細胞中，G6PD通過HBV提高自身表達量來促進腫瘤發展［13］。之前的研究往往認為G6PD是一種促癌基因，因而忽略了對于已經發生癌變的癌細胞，高水平G6PD可能產生的后果。本研究補充了肝癌這一方面的研究，以肝癌細胞株PLC/PRF/5同時建立了G6PD敲低及過表達的細胞株，并對它們進行了增殖及遷移生物學功能的初步探索，為之后深度研究G6PD及PPP對肝癌的影響打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與細胞株大腸桿菌DH5α、293T細胞株、過表達、干擾質粒及慢病毒包裝質粒購自廣州復能有限公司，PLC/PRF/5細胞株購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 試劑質粒提取試劑盒購自Omega公司、G6PD活性檢驗試劑盒購自Biovison公司、NADP/NADPH含量測定試劑盒購自Sigma公司、Trizol及Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司，G6PD、GAPDH抗體及二抗均購自CST，反轉錄試劑盒、RTPCR試劑盒購自Takara，EDU試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.1.3 儀器實時熒光定量PCR儀（ABI7500）、化學發光成像系統（伯樂ChemiDoc XRS+），超微量分光光度計（BioTeKEpoch2）、倒置熒光顯微鏡（萊卡DMi8）、雙模塊PCR儀（伯樂S100048/48雙模）、細胞計數儀（Countstar IC?1000）、RealTime Cellular Analysis（RTCA）System來自美國艾森公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養從液氮罐中取出凍存細胞PLC/PRF/5及293T，37℃水浴鍋快速復蘇，以DMEM+10%FBS培養，置于37℃5%CO2孵箱培養，定時換液、傳代。

1.2.2 Real?time PCR檢測以Trizol提取細胞總RNA，以此檢測各組細胞中G6PD mRNA表達，G6PD real?time PCR 的引物為 Forward：5′?CGCCT?CACAGTGGCTGACATC?3′，Reverse：5′?ACCCCAG?GTGGAGGGCATT ?3′，GAPDH的引物為：Forward：5′?ATCACCATCTTCCAGGAGCGAG?3，Reverse：′5′?GGGCAGAGATGATGACCCTTTTG?3′，按說明書配制反應體系，反應體系20 μL，以95℃反應10 min，再以 95℃ 15 s、60℃ 60 s擴增40個循環。

1.2.3 Western blot檢測以冷凍PBS清洗6孔板中細胞2次，每孔加入400 mL RIPA細胞裂解液，置于冰上裂解15 min，4℃13 000g離心10 min，取上層澄清液體，加入5×loading buffuer，留取部分以BCA法測定總蛋白濃度。以1×loading buffer調節兩組蛋白濃度至一致，取約50 μg的總蛋白經10%SDS?PAGE 膠，經80 V 30 min、120 V 60 min電泳后，以200 mA恒流轉膜2 h，經封閉2 h和抗體孵育，通過化學發光成像系統曝光成像。

1.2.4 慢病毒包裝、濃縮及滴度測定轉染前1 d 293T細胞傳代，使次日轉染時細胞融合度達70%～80%。在離心管中按量將lipo3000溶于Opti培養基中，于另一管中以3∶2∶1比例將目的質粒、PsPAx2、PVSVg三種質粒溶于Opti培養基并加入p3000，將兩管液體輕柔混合，靜止5 min后將質粒-脂質體混合液加入293T細胞中并補加完全培養基，之后置于培養箱中培養。于24 h倒置顯微鏡下觀察轉染效率（重組慢病毒質粒攜帶綠色GFP熒光蛋白基因），48及72 h后收集含慢病毒顆粒的培養基，以10 KD超濾離心管濃縮病毒液，檢測病毒顆粒滴度，-80℃保存。

1.2.5 細胞株的感染及藥物篩選將所收集慢病毒液加入PLC/PRF/5，并加入Polybrene協助感染，觀察細胞形態及生長狀態無明顯異常。48 h觀察細胞感染效率。根據前期實驗所得PLC/PRF/5細胞株的Puro最小致死濃度（3 μg/mL）加入Puro進行藥篩。藥篩時間2周，按需換液傳代。

1.2.6 EDU增殖實驗取對數生長期各組細胞接種至12孔板中，使得次日細胞密度適中（50%～80%）。次日先以配制好的EDU培養基37℃培養2 h，經清洗、細胞固定化、Apollo染色、DNA染色后，置于倒置熒光顯微鏡下先后以紫光、綠光為激發光曝光，分別得到全細胞及處于復制階段的細胞核圖像，10倍鏡及20倍鏡下每孔拍照10張，計算處于復制階段的細胞比例并統計差異。

1.2.7 遷移及增殖曲線記錄取對數生長期細胞計數，以無血清DMEM調整細胞密度至1×105個/mL，接種至與儀器配套的12孔遷移板上室中（200 μL/孔），下室中加入100 μL血清，位于孔板底部的金屬電極將記錄穿室細胞的電阻以反映細胞遷移能力，記錄觀察48 h內的遷移曲線。增殖曲線依同理記錄100 h內細胞生長指數數據。

1.2.8 克隆形成實驗取對數生長期細胞消化吹打成單細胞，以細胞計數儀計算細胞懸液中細胞密度，每組細胞以100個每孔接種至6孔板中，加入完全培養基至2 mL，吹打細胞使其分布均勻，置于培養箱中培養2～3周。按時觀察，至出現肉眼可見克隆時，終止培養，棄上清PBS清洗，以4%多聚甲醛固定細胞15 min，后以0.1%結晶紫染色液染色15 min，清水浸洗直至洗凈，拍照記錄克隆形成情況，計算各組克隆形成率（克隆數/接種細胞數×100%）。

1.3 統計學方法所有實驗至少重復3次，數據采用SPSS 13.0軟件進行分析，數據以表示，組間數據比較采用t檢驗，P＜0.05視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PLC/PRF/5穩轉細胞株的建立鑒定包裝G6PD敲低及過表達慢病毒顆粒，經慢病毒感染、Puro藥篩PLC/PRF/5細胞株獲得熒光穩定的PLC/PRF/5敲低細胞株（PLC?G6PD shRNA）及其對照組（PLC?Scramble shRNA）、過表達細胞株（PLC?Lv201?G6PD）及其對照組（PLC?Lv201?Con）。定量PCR檢驗mRNA水平變化，敲低效果達92.5%，過表達效果達13.89倍。Western檢驗蛋白水平變化量，過表達同時明顯過表達了G6PD的2種亞型；由灰度值計算，敲低效果則達95.2%（圖1）。

圖1 RT?PCR及Western blot檢測敲低及過表達PLC/PRF/5中G6PD的表達情況Fig.1 Detection of mRNA and protein expression of G6PD in G6PD knockdown and overexpression cells PLC/PRF/5 via RT?PCR and Western blotting assays

2.2 增殖生長能力的檢驗據細胞生長曲線可知，PLC?G6PD shRNA、PLC?Scramble shRNA、PLC?Lv201?G6PD、PLC?Lv201?Con四株細胞在接種后第3天進入對數生長期（圖2A）。但細胞株PLC?G6PD shRNA較對照組倍增時間延長，生長速率明顯下降，增殖受到抑制，與PLC?Scramble shRNA相比，在培養的第48～ 100小時，PLC?G6PD shRNA細胞指數較對照組降低了50.2%～61.25%（圖2A），EDU顯示的增殖細胞比例較對照組低43.2%（圖2B），平均克隆形成率降低了67.2%（P＜ 0.05）（圖2C）。而過表達細胞株PLC?Lv201?G6PD較對照組PLC?Lv201?Con增殖及克隆形成實驗差異無統計學意義（圖A2～C）。

2.3 遷移能力檢測由RTCA系統所測的48 h內細胞遷移曲線可知，過表達組細胞與對照組間差異無統計學意義，而敲低細胞株較其對照組，遷移能力顯著降低（圖3）。

3 討論

磷酸戊糖途徑不論在正常細胞還是腫瘤細胞中都發揮著重要作用，一方面，PPP可通過其氧化分支產生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adeninedinucleotide phosphate，NADPH），NADPH 是細胞內重要的還原當量，通過還原性谷胱甘肽（GSH）對細胞內生成的氧自由基、過氧化物清除，避免氧化損傷，是細胞生長和增殖的必要條件；另一方面，PPP通過非氧化分支產生核苷酸合成的重要前體五磷酸核糖（ribose?5?phosphate，R?5?P），R?5?P是細胞增殖分裂的必需物質，對細胞的生長十分重要，尤其對腫瘤細胞而言，在腫瘤細胞中PPP為DNA合成提供了約85%的戊糖［14］。

在本研究中，通過shRNA敲低PPP關鍵酶G6PD的表達，測得G6PD活性、細胞中NADPH的產量均下降（未發表數據），這與隨后實驗中細胞增殖、克隆形成及遷移能力顯著下降的實驗結果相符合。如上所述，PPP的主要產物是NADPH，NADPH可維持細胞中重要還原物質谷胱甘肽GSH的水平，用以減少細胞中的活性氧ROS，減少細胞氧化損傷及凋亡程度，故當G6PD蛋白的功能不足以維持細胞內的氧化還原平衡時，細胞的增殖及克隆形成能力受到抑制，同時，PPP非氧化分支的減弱，減少了腫瘤細胞中磷酸戊糖的供應，也足以抑制細胞的分裂增殖。另一方面，本研究中發現過表達G6PD時，雖然活性G6PD的量相應增加，但是從細胞中的NADPH含量直至細胞的增殖、遷移均未發生存在統計學差異的變化，這也許因為細胞正常生長中G6PD的量已然足夠維持細胞中的氧化還原平衡，故而雖然細胞中的G6PD總量以及活化形式的G6PD含量上升，卻不會改變細胞中氧化還原的底物、產物間的平衡。

圖2 G6PD敲低及過表達細胞增殖及生長情況Fig.2 Cell proliferation and growth in G6PD knockdown and overexpression cells

圖3 G6PD敲低及過表達細胞遷移情況Fig.3 Migration curve analyses in G6PD knockdown and overexpression cells

本研究初步證實了G6PD在肝癌細胞株PLC/PRF/5中發揮著類似癌基因的作用，能夠促進肝癌細胞的增殖、生長、遷移，為了探索肝癌細胞的代謝特征及PPP在肝癌細胞代謝中的地位，我們將對所建細胞株中糖消耗、乳酸含量、脂質等代謝物進行檢測，研究G6PD及PPP對腫瘤代謝的全面影響；同時深入探討G6PD發揮作用的機制，現已有研究表明p53可通過與G6PD的直接結合降低活性G6PD的含量而發揮抑癌作用［15］，白血病細胞中SIRT2通過對G6PD的乙酰化修飾提高G6PD的活性而促進腫瘤生長［16］，在肝癌細胞中PTEN可通過Tcl1/hnRNPK通路抑制G6PD前體mRNA的剪接發揮抗癌作用［17］，可見多種信號通路影響著G6PD的表達、活性，為了尋找其他影響G6PD的上游基因以及受G6PD影響的下游基因，我們已將表型變化明顯的G6PD敲低組與對照組樣品進行全基因組芯片檢測，以期挖掘與G6PD相關的功能基因，深入探索G6PD及PPP的改變在肝癌發生發展中所發揮的機制。

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