小麥溫敏雄性不育系BNS366小孢子發育和花粉育性檢測方法研究

劉海英，甄俊琦，胡鐵柱，茹振鋼，李 珍，胡雪寒，邢晨濤，高 遠

(1.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉 453007； 2.河南科技學院小麥中心，河南新鄉 453003)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界主要糧食作物。利用雜交優勢提高小麥產量、增強小麥抗性已經成為提高小麥產量的重要途徑[1]。利用小麥雄性不育系[2]，尤其是溫敏雄性不育系進行“二系法”雜交小麥育種，逐漸成為雜交優勢利用的主要手段[3]。溫敏雄性不育系花粉敗育的機制研究對于小麥雜交制種具有重要的理論意義，其中，花粉育性的檢測是開展相關研究的細胞學基礎[4]。

BNS是一個新發現的雄性不育系[5]，其花粉發育在抽穗前對溫度敏感，當溫度小于8.9 ℃時徹底不育，溫度在8.9～14.4 ℃之間育性逐漸恢復，溫度大于14.4 ℃時育性完全恢復[6]。BNS366是BNS和普通小麥品種鄭麥366經飽和回交轉育而成的新品系[7]，具有與BNS一樣的育性轉換規律，與鄭麥366僅存在溫敏基因的差異，BNS366和鄭麥366構成一對近等基因系。前人針對BNS366小孢子發育的細胞學觀察一般以常規小麥品種為對照[8]，以其近等基因系鄭麥366為對照開展細胞學觀察，對于揭示BNS366小孢子發育過程中的細胞學現象具有更明顯的優勢，但目前缺乏相關報道。

前人已經對水稻[9-10]、煙草[11]、玉米[12]、蘿卜[13]、油菜[14]、小麥[3]等做過細胞學育性檢驗研究。目前，研究花粉育性的手段主要有I2-KI[3,4,6]、醋酸洋紅[3]和蘇木精[9,12,14-15]染色。李自超等[9-10]認為，I2-KI染色法不能準確反映水稻花粉的育性。醋酸洋紅[3,8,13]、蘇木精[9,12,14-15]和改良苯酚品紅[16]均為細胞核染液。前人對醋酸洋紅使用最多，染色效果及對花粉育性的檢驗也最為理想[3,8,13]；其次是蘇木精，用其對花粉育性研究的誤差不大[9,12,14-15]。有關改良苯酚品紅對于花粉育性的研究目前報道較少。在以往的研究中，多使用上述4種方法的一種或兩種進行細胞育性的檢測和比較[3,4,6,8-10,12-15]，對這4種方法的系統性比較鮮見報道。本研究以BNS366和鄭麥366為試驗材料，探究4種染色方法的染色效果及其對小麥花粉育性檢測的準確性，以建立溫敏雄性不育小麥BNS366小孢子發育和花粉育性檢測的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為溫敏小麥雄性不育系BNS366，以其近等基因系鄭麥366為對照，均由河南科技學院小麥中心選育并提供種子。所有材料于2016年10月11日正常秋播于河南師范大學小麥試驗田，次年選代表型植株進行研究。

1.2 方 法

1.2.1 細胞學觀察

在溫敏小麥雄性不育系BNS366和鄭麥366雄蕊發育的單核靠邊期(小麥穗芒從旗葉葉鞘中伸出長度≤1 cm)、二核期(小麥穗從旗葉葉鞘中伸出1/2穗長)、三核期(小麥穗從旗葉葉鞘中剛剛完全伸出)和開花期(小麥穗中部小穗1、2位小花花藥為黃色，花絲伸長至花藥接近內外稃頂部)，在上午9:00～10:00，各取10個穗子固定，分別用I2-KI、醋酸洋紅、蘇木精和改良苯酚品紅法染色、制片，在Leica DMIL倒置熒光顯微鏡下用白光觀察、拍照和統計，分析小孢子發育過程和花粉粒育性表現?？捎?可育花粉數/花粉總數×100%。花粉育性統計結果取平均值。具體制片和觀察過程如下。

(1)取材和固定：將不同花藥發育時期所取樣品剪去麥穗頂部6個小穗和基部6個小穗，留下中部小穗后置于FAA固定液(50%乙醇、冰醋酸和福爾馬林按18∶1∶1的體積比配制)中保存備用。

(2)I2-KI法染色、制片和觀察：取一個潔凈載玻片，滴1～2滴I2-KI溶液，取(1)中固定好的麥穗1個，沿麥穗自下而上從不同小穗1、2位小花中取3～5枚花藥，每枚花藥均來自不同小穗，用鑷子夾碎使花粉粒流出，去除殘渣，蓋上蓋玻片?；ǚ哿ｏ枬M、圓形、淀粉積累多、染色深的為可育花粉，否則為敗育花粉。其中，花粉粒干癟為典敗，呈圓形不能染色或染色淺分別為圓敗或染敗。

(3)醋酸洋紅法染色、制片和觀察：取(1)中固定好的麥穗1個，用70%乙醇置換兩次，每次30 min；用70%乙醇保存在4 ℃冰箱中備用。取一個潔凈載玻片，滴1～2滴醋酸洋紅(Sigma)溶液，從麥穗上取3～5個花藥(方法同I2-KI法染色)，鑷子夾碎，去除殘渣，蓋上蓋玻片(三核期和開花期玻片制好后，酒精燈上烤片，將載玻片從酒精燈外焰中反復穿過，保持樣品所在區域不至沸騰，感覺載玻片底部發熱微燙，30 min左右，下同)。能看到細長拉伸呈魚尾狀精核的為可育花粉；花粉?；巍⒅荒芸吹綘I養核，看不到正常發育的精核或花粉無任何著色部分都視為不育。

(4)蘇木精法染色、制片和觀察：取(3)中在4 ℃冰箱中保存備用的麥穗1個，取一個潔凈載玻片，滴1～2滴Weigert蘇木素染色液(Solarbio)，從麥穗上取3～5個花藥(方法同I2-KI法染色)，鑷子夾碎，去除殘渣，蓋上蓋玻片(鄭麥366三核期和開花期的花粉粒染色10 min左右蓋片)，酒精燈上烤片0.5 min后鏡檢觀察細胞核染色情況，細胞核觀察不清楚時增加烤片次數，每次0.5 min后繼續鏡檢觀察，直至鏡檢觀察到清晰的細胞核為止，一般需烤片3次[15]。

(5)改良苯酚品紅法染色、制片和觀察：將(3)中在4 ℃冰箱中保存備用的麥穗取出，取一個潔凈載玻片，滴1～2滴改良苯酚品紅溶液，從置換后的麥穗上取3～5個花藥(方法同I2-KI法染色)，鑷子夾碎，去除殘渣，蓋上蓋玻片(鄭麥366三核期和開花期玻片制好后，酒精燈上烤片0.5 min后鏡檢觀察細胞核染色情況，細胞核觀察不清楚時增加烤片次數，每次0.5 min，至鏡檢觀察到清晰的細胞核，一般最多烤片兩次。

1.2.2 套袋自交結實率調查

對試驗材料于抽穗后開花前分別套袋，使其自交，成熟期各隨機選取10個麥穗，按國內法[17]調查和統計自交結實率。

1.3 數據分析

采用Excel 2010和SPSS 16.0進行數據統計、處理和分析。

2 結果與分析

2.1 小孢子發育進程中不同染色法染色效果

2.1.1 I2-KI法染色效果

BNS366小孢子在單核靠邊期(圖1A)可見一個細胞核，到二核期(圖1B)少數小孢子中可見兩個細胞核，但均模糊不清，三核期(圖1C)和開花期(圖1D)未見淀粉積累，細胞核彌散，部分細胞內找不到細胞核，單核靠邊期之后小孢子外形逐漸皺縮成不規則三角形或癟皮球狀。鄭麥366單核靠邊期小孢子染色結果(圖1E)和BNS366相似，二核期(圖1F)可見部分小孢子具有兩個細胞核，與BNS366相比較多，但仍然模糊不清，三核期(圖1G)小孢子內可見淀粉積累，但淀粉積累仍不充分，開花期(圖1H)大部分小孢子內淀粉達到充足狀態，在三核期和開花期完全看不到細胞核，花粉粒外形為飽滿圓形。表明，BNS366小孢子發育從二核期已經開始出現異常，正常具有兩個細胞核的花粉粒較少，三核期之后完全沒有淀粉的積累，其敗育在單核靠邊期向二核期轉變時開始。用I2-KI染色法能夠清晰觀察到小麥小孢子內淀粉積累的情況，通過開花期花粉粒內淀粉的積累情況可以輔助判斷花粉的育性，但對小孢子發育過程中細胞核的觀察幫助不大。

2.1.2 醋酸洋紅法染色結果

在單核靠邊期，BNS366和鄭麥366小孢子中均能看到一個紅色細胞核(圖2A和圖2E)，在二核期可清晰看見兩個細胞核(圖2B和圖2F)。BNS366在三核期到開花期多數小孢子中細胞核消失，少數小孢子可見一個細胞核(圖2C和圖2D)。鄭麥366在三核期小孢子中開始出現三個細胞核(圖2G)，但細胞核沒有發育完全，染色并不明顯；開花期(圖2H)細胞核完全發育，可清楚觀察到多數小孢子中有兩個紅色魚尾狀細胞核(精核)與一個紅色圓形細胞核(營養核)。鄭麥366在三核期小孢子內模糊可見內容物但積累不充分，至開花期內容物充滿整個花粉粒。說明醋酸洋紅染色法可以觀察到BNS366和鄭麥366小孢子發育進程，并判斷出BNS366敗育期介于單核靠邊期與二核期之間；醋酸洋紅染色法可以清晰觀察細胞核的發育進程，也可以反映細胞內容物的積累情況，但觀察效果比較模糊，且不能明確指示細胞內容物的主要成分。

A～D:BNS366; E～F:鄭麥366; A、E:單核期; B、F:二核期; C、G:三核期; D、H:開花期. 下同。

A-D:BNS366; E-F:Zhengmai 366; A,E:Uninucleate period; B,F:Binucleate period; C,G:Trinucleate period; D,H:Flowering period.The same in other figures.

圖1BNS366和鄭麥366花粉粒I2-KI染色

Fig.1PollengrainsofBNS366andZhengmai366stainedwithI2-KI

圖2 BNS366和鄭麥366花粉粒醋酸洋紅染色

2.1.3 蘇木精法染色結果

BNS366和鄭麥366小孢子單核靠邊期與二核期細胞圖像均清晰，細胞核和細胞質對比明顯，能清楚觀察到細胞核(圖3A、圖3B、圖3E和圖3F)，與醋酸洋紅法染色相比，細胞核的清晰度更高。BNS366三核期和開花期小孢子中細胞核不明顯(圖3C和圖3D)。鄭麥366三核期小孢子中有內容物的積累，細胞核沒有發育完全，染色不清楚(圖3G)。鄭麥366開花期多數小孢子中能觀察到兩條魚尾狀的精核和一個營養核(圖3H)。與醋酸洋紅染色法相比，蘇木精染色法觀察到的鄭麥366在三核期和開花期細胞核清晰度較低。鄭麥366在三核期小孢子內出現內容物但積累不充分，到開花期內容物充滿整個小孢子。說明在無內容物出現前，蘇木精染色法比醋酸洋紅法更容易觀察到小孢子細胞核的發育情況。發現BNS366花粉敗育時期介于單核靠邊期到二核期。內容物形成后，細胞核與內容物之間的顏色反差小，與醋酸洋紅法相比細胞核清晰度較差，可以指示內容物的積累情況，但與醋酸洋紅法相似，既對內容物的指示不清晰，也不能顯示內容物的種類。

2.1.4 改良苯酚品紅法染色結果

用改良苯酚品紅法染色，BNS366小孢子所有時期和鄭麥366小孢子單核靠邊期與二核期，內容物沒有積累，染色清晰，可明顯看出細胞核的形態(圖4A～圖4F)，清晰度比I2-KI染色法高，但比醋酸洋紅法和蘇木精法染色清晰度低，與上述3種染色方法觀察到的細胞核變化趨勢相似。鄭麥366小孢子三核期出現三個沒有發育完全的細胞核(圖4G)，開花期(圖4H)多數細胞核呈魚尾狀，不容易看到醋酸洋紅法和蘇木精法染色所看到的典型三細胞核圖像；在三核期可見內容物的積累但不充分，至開花期內容物充滿整個花粉粒。說明用改良苯酚品紅法染色，可以對小麥小孢子發育情況進行觀察，但其對細胞核染色效果不如醋酸洋紅法和蘇木精法，對內容物的指示效果不如I2-KI法染色。

2.2 花粉育性與自交結實率比較

由表1可知，以鄭麥366開花期花粉為材料，采用I2-KI染色法觀察到的花粉可育率最高，極顯著高于其自交結實率；采用蘇木精法和醋酸洋紅法染色觀察到的花粉可育率較低，與自交結實率的吻合度高；采用改良苯酚品紅法染色觀察到的花粉可育率最低，極顯著低于自交結實率。說明采用蘇木精法和醋酸洋紅法染色確定小麥花粉育性的可靠性更強。

圖3 BNS366和鄭麥366花粉粒蘇木精染色

圖4 BNS366和鄭麥366花粉粒改良苯酚品紅染色

Table1DifferencesinZhengmai366pollenfertilityratesandtheirselfingseedsetrateanalyzedbydifferentstainingmethods%

I2?KI法I2?KI?stain醋酸洋紅法Acetatecarmine?stain蘇木精法Haematoxylin?stain改良苯酚品紅法Carbolfuchsin?stain自交結實率Selfingseedsetrate92．41aA79．15bAB82．92abAB57．10cC74．88bB

數據后不同小寫和大寫字母分別表示0.05和0.01水平上的差異顯著。

Values followed by different small and capital letter are significantly different at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

3 討 論

3.1 不同染色方法對BNS366和鄭麥366小孢子發育過程觀察結果的影響

采用4種不同染色法，均可以清楚看到BNS366在二核期僅有少數小孢子內出現兩個細胞核，在三核期和開花期則多數小孢子內細胞核缺失，且小孢子內容物缺失，由此可以判斷BNS366小孢子敗育的時期在單核靠邊期到二核期間，這與賀曉敏等[8]的研究結果相一致。表明在本試驗條件下觀察到的細胞學特征準確可靠，可以嘗試采用這4種染色方法進行進一步細胞學研究。

3.2 不同染色方法對BNS366和鄭麥366小孢子發育精細觀察和花粉育性預測結果的影響

3.2.1 I2-KI法染色

I2-KI染色可使淀粉深染[10]。禾谷類花粉發育過程中會逐漸積累淀粉，成熟期淀粉積累達到頂峰。發育良好的花粉能被I2-KI染成藍黑色，發育不良的花粉常呈畸形，不含淀粉或淀粉積累較少，往往被I2-KI染成黃褐色[16]。人們常用染色法觀察花粉中淀粉的含量和特性[8]。在本試驗中，I2-KI法能十分準確地反映花粉粒中淀粉的積累情況。在李自超等[8]的試驗中，實際調查的水稻結實率為49.91%的情況下，I2-KI法得到的花粉可育率為78.30%，遠遠高于結實率。李自超等[9]認為此方法對于敗育時期較早的花粉(單靠期或二核期的敗育)比較有效，但對于三核時期的敗育，由于此時已經積累了較多淀粉，難以用此法區分，因此不能反映花粉的真實育性。本試驗中，結實率為74.88%，I2-KI法的花粉可育率為92.41%，同樣極顯著高于結實率。因此認為I2-KI法染色能觀察到花粉中淀粉積累的過程，但對于檢測花粉的育性仍存在難以鑒別出染色深但實際不育花粉的缺陷。

3.2.2 醋酸洋紅法染色

醋酸洋紅為細胞核染料[8]，本試驗結果顯示其將細胞核染成紅色。周美蘭等[8]曾用其對小麥花粉進行染色，能十分清晰地觀察到細胞核的形態。本試驗中，除了三核期細胞核還沒發育完全，觀察效果不是十分清楚外，其余各個時期的細胞核都能十分清楚地觀察到，且此染色法去除了淀粉的影響，可直接觀察到開花期小孢子中有兩個正常的精核，從理論上講此法更加有效。本試驗中，結實率為74.88%，醋酸洋紅法染色得出的育性為79.15%，兩者差異不顯著，能極好地反映花粉的育性。

3.2.3 蘇木精法染色

蘇木精同樣為細胞核染料[9]，可將小麥花粉母細胞的細胞核染成紫藍色。李自超等[9]采用該方法檢測水稻的育性時，實際調查的結實率為63.75%，統計的花粉可育性率為67.90%，兩者較為接近，認為此法能很好地反應花粉的育性。在本試驗中，小麥結實率為74.88%，蘇木精法染色統計的花粉可育性率為82.92%，與醋酸洋紅法染色的花粉可育率三者之間差異均不顯著，用此法也能檢測花粉育性。但蘇木精法染色在三核期和開花期的染色效果不如醋酸洋紅法好，且在烤片時需反復烤片，操作較為復雜，在有醋酸洋紅法的前提下，不建議使用蘇木精法檢測花粉育性。若單單只是為了觀察花粉發育前期細胞核，此法的染色效果優于醋酸洋紅法。

3.2.4 改良苯酚品紅法染色

改良苯酚品紅也為細胞核染料[18]，能將細胞核染成紫紅色。改良苯酚品紅法染色效果不如上述醋酸洋紅和蘇木精兩種染核試劑，染色結果并不十分理想，且需要兩次烤片，在開花期經過烤片后仍不能十分明顯地觀察到兩個魚尾狀的精核。且在前人檢測育性的研究中，很少人使用此種染色方法。本試驗中，小麥結實率為74.88%，此染色法統計花粉育性為57.10%，極顯著低于結實率。在檢測花粉育性時，不建議使用此法。

本試驗結果表明I2-KI法能很好地反映出花粉粒中淀粉積累的情況，但對小麥花粉育性預測結果偏高；醋酸洋紅法整體對花粉染色效果較好，且可育率與結實率接近，對花粉育性檢測準確；蘇木精法對育性檢測誤差不大，但對成熟花粉染色步驟麻煩，染色效果不如醋酸洋紅法，但對發育前期花粉染色效果優于醋酸洋紅法，可對小麥發育前期花粉進行染色鑒定。改良苯酚品紅法染色效果不好，且對育性檢測誤差較大，不建議使用。

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