蒼南地區前列腺癌與HPV16/18感染的相關性研究

黃兆浪 莊小藝 周炳同 溫莉虹

高危型人乳頭瘤病毒（HPV）持續感染是導致宮頸上皮內瘤變和宮頸癌產生的必要條件[1]，在高危型HPV中以HPV16/18感染最為常見，研究表明其至少占70%以上[2]。目前，文獻中關于HPV16/18感染與男性生殖系統腫瘤的關系，特別是與前列腺癌（prostate cancer，PCa）的關系研究較少。本研究采用原位雜交方法檢測PCa石蠟標本中HPV16/18感染情況，并與同期良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）作對照研究，同時采用免疫組化En Vision法檢測上述患者p16的表達情況，留取患者的尿液和部分活檢新鮮組織標本分別做尿液和電鏡HPV檢查，探討HPV16/18感染與本地區PCa發生的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 選取本院2012至2016年PCa患者存檔石蠟標本 64例（PCa組），年齡 57～95（77.1±7.9）歲。抽取同期BPH患者72例作對照研究（BPH組），年齡59～88（72.7±7.2）歲。其中2016年臨床診斷為PCa的19例患者及BPH的27例患者同時留取尿液檢測高危型HPV，10例PCa和7例BPH患者的活檢新鮮組織標本電鏡觀測病毒樣顆粒。上述檢查結果均經2位高年資病理醫師復閱確診后選取。

1.2 方法

1.2.1 原位雜交方法檢測HPV16/18感染情況 所有石蠟組織按如下程序進行：10%中性甲醛固定、石蠟包埋切片、脫蠟、酶處理、變性雜交、顯色、復染等。所有標本均設陰性對照與陽性對照，最后以細胞核呈棕黃色顆粒為陽性，無著色為陰性。

1.2.2 免疫組化En Vision法檢測p16表達情況 10%中性甲醛固定的組織經脫水、包埋、切片后按免疫組化說明書的步驟進行操作，設置陽性對照與陰性對照，再進行復染、中性樹膠封固，最后光鏡下觀察。光鏡下陽性為胞核呈棕黃色或胞核與胞質同時呈棕黃色，陰性為胞質單獨著色或無著色。

1.2.3 尿液中高危型HPV的檢測 采用第二代雜交捕獲（HC2）法。留取患者清晨第一次前段尿液約10ml，置于15ml消毒帶蓋的離心試管中，經離心、DNA裂解、雜交捕獲反應、沖洗、信號收集后在DML2000系統上進行結果判讀，與標準陽性進行對照。檢測樣本的相對光單位（relative light unit，RLU），并且與標準陽性的 RLU 對比，如兩者比值≥1.0，提示高危型HPV感染，如＜1.0為陰性。

1.2.4 電鏡觀測組織中的HPV 活檢新鮮組織標本立刻投入2.5%戊二醛緩沖液中作前固定（溫度4℃），然后改切為1mm 3小塊、經緩沖液充分浸洗后、以1%四氧化餓溶液作后固定，采用超薄切片機切片、厚度50nm左右、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，最后用國立H500透射電鏡觀察攝像。在細胞核內見到病毒樣顆粒（在異染色質之間呈彌漫散布無明顯結構或聚集成團呈假結晶狀）為陽性，未見到者為陰性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者HPV或p16陽性率比較 PCa組石蠟標本中HPV16/18和p16陽性率均明顯高于BPH組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；兩組尿液中高危型HPV陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。HPV16/18和p16陽性表達情況見圖1-2（插頁）。

2.2 電鏡觀測所見 納入電鏡檢查的10例PCa新鮮組織標本表現為細胞核大小不一，畸形或異形，核仁粗大，伴有雙核仁或多核仁。胞質內形成大小不一、內含微絨毛的微囊，其中4例在細胞核內見到病毒樣顆粒，表現為在異染色質之間呈彌漫散布無明顯結構或聚集成團呈假結晶狀，見圖3。7例BPH新鮮組織標本電鏡下胞質內富含致密體和溶酶體，核仁不明顯，核大而不規則，未見病毒樣顆粒。

表1 兩組患者HPV或p16陽性率比較（%）

圖3 電鏡表現（a、b：白色箭頭示HPV樣顆粒在異染色質之間呈彌漫散布無明顯結構或聚集成團呈假結晶狀，透射電子顯微鏡，×30 000；M：核膜；N：核仁）

3 討論

PCa是常見的男性惡性腫瘤，其發病率位居全球男性惡性腫瘤的第2位[3]。近年來我國發病率呈明顯上升趨勢，由2003年的6.53/10萬上升至2009年的9.92/10萬[4]。

PCa發病機制至今仍不明確。盡管雄激素及雄激素受體（AR）信號在前列腺腺體內環境的穩定和發育中是必要的，并且AR信號幾乎驅動著所有PCa細胞的生長，但是雄激素和AR信號是否參與了PCa的發生和增殖的早期階段，并沒有定論[5]。有研究表明前列腺組織較易被潛在致瘤性的病毒感染，包括HPV、多瘤病毒和皰疹病毒等[6]。其中，HPV作為最重要的腫瘤相關性病毒之一，已被證實與多種腫瘤的發生、發展密切相關。現代研究已經證實HPV感染特別是高危型HPV持續感染是導致宮頸上皮內瘤變和宮頸癌產生的必要條件[1]，這其中又以HPV16/18感染最為常見，其至少占70%以上[2]。近年來分子生物學研究表明HPV16/18的E6/E7蛋白可使前列腺上皮細胞永生化[7]。

E6蛋白含151個氨基酸，包括2個鋅指狀結構Cys-x-x-Cys，E7 蛋白含 CR1、CR2、CR3 等 3 個功能區的磷酸化核蛋白，共有98個氨基酸[8]。E6/E7蛋白可分別結合、降解抑癌基因p53及Rb，致使細胞過度增殖和細胞周期調控失常，最終促使PCa的發生、發展[7]。

p16是一種多腫瘤抑癌基因，于1992年由Travis[9]在研究黑素瘤基因時首次發現，該基因位于染色體9p21，其中包含2個內含子和3個外顯子。研究表明HPV一過性感染可能不會出現p16過表達，而持續感染可能使Rb基因與其致癌蛋白E7結合后失活，從而釋放轉錄因子E2F，破壞p16的負向調節通路，最終導致腫瘤的發生[10]。

國外對PCa與HPV16/18感染的相關性研究報道的較多，如Carozzi等[11]運用PCR方法檢測發現PCa患者中HPV16/18陽性表達明顯高于BPH患者。國內這方面的研究少見報道。近年來，韋正樹等[12]采用聚合酶鏈反應結合反向點雜交（PCR-RDB）技術檢測了60例PCa患者和55例BPH患者前列腺組織中HPV16/18 DNA的表達情況，發現前者陽性率為36.7%（22/60），后者為9.1%（5/55），兩組比較差異有統計學意義。本研究采用原位雜交的方法，結果表明PCa組HPV16/18陽性表達率為23.4%，BPH組為4.2%，兩組比較差異有統計學意義；同時p16的免疫組化結果顯示前者陽性率為25.0%，后者為8.3%，兩組比較差異有統計學意義。上述結果提示HPV16/18感染可能與本地區PCa發病相關。本組送檢的10例PCa新鮮組織電鏡檢測發現4例胞核內見病毒樣顆粒，而7例BPH組織均未見病毒樣顆粒，進一步提示PCa與HPV感染有關。

Zambrano等[13]研究發現PCa患者尿液中HPV DNA陽性率高，在其選取的12例PCa患者尿液組織中檢測到6例HPV DNA陽性。本研究顯示PCa組尿液中高危型HPV陽性率為47.4%，BPH組為18.5%，PCa組陽性率明顯高于BPH組，可能與本地區自然環境、生活習慣等不同有關。

綜上所述，本地區PCa與HPV16/18的感染存在相關性，HPV16/18的感染可能是本地區PCa的發病因素之一。本研究受條件所限，只針對高危型HPV16/18進行了檢測，對其他類型HPV未進行相關檢測，結果可能存在一定的誤差，有待于今后進一步研究。

[1]Qmichou Z,KhyattiM,Berroho M,et al.Anaysis of mutations in the E6 oncogene of human papillomavius 16 in cervical cancer isolares from Moroccan women[J].BMC Infect Dis,2013,13(1):378.doi:10.1186/1471-2334-13-378.

[2]Castle PE,Maza M.Prophylactic HPV vaccination:past,present,and future[J].EpidemiolInfect,2016,144(3):449-468.doi:10.1017/S0950268815002198.

[3]Lindsey AT,Freddie B,Rebecca LS,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.doi:10.3322/caac.20107.

[4]韓蘇軍,張思維,陳萬青,等.中國前列腺癌發病現狀和流行趨勢分析[J].臨床腫瘤學雜志,2013,18(4):330-334.doi:10.3969/j.issn.1009-0460.2013.04.009.

[5]鮑文華,陳福軍,楊澤.前列腺癌發病機制中雄激素和雄激素受體信號的作用[J].中國老年保健醫學雜志,2015,13(1):9-12.doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2015.01.002.

[6]Fioriti D.A case of human polyomavirus Bk infection in a patient aff-ected by latestage prostate could viral infection be correlated with cancer progression[J].Int J Immunopathol Pharmacol,2007,20(2):405-411.doi:10.1177/039463200702000223.

[7]Chen AC.Human papillomavirus in benign prostatic hyperplasia and prostatic adenocarcinoma patients[J].Pathol Oncol Res,2011,17(3):613-710.doi:10.1007/s12253-010-9357-4.

[8]Zhang Y,Dasgupta J,Ma RZ,et al.Structures of a HPVE6 polypeptide bound to MAGUK proteins:mechanisms of targeting tumor suppressors by a high-risk HPVoncoprotein[J].Virol,2007,81(7):3618-3626.doi:10.1128/JVI.02044-06.

[9]Travis J.Closing in on melanoma susceptibility gene(s)[J].Science,1992,258(5085):1080-1081.doi:10.1126/science.1439815.

[10]羅陽剛,呂玉宇.HPVL1殼蛋白與P16蛋白聯合檢測在宮頸癌前病變中的臨床意義[J].檢驗醫學與臨床,2015,12(22):3314-3317.doi:10.3969/j.issn.1672-9455.2015.22.009.

[11]Carozzi F,l.ombardi FC,Zendron P,et al.Association of human pap-illomavirus with prostate cancer:analysis of a consecutive se-Ties ofprostate biopsies[J].Int J BiolMarkers,2004,19(4):257-261.doi:10.5301/JBM.2008.3977.

[12]韋正樹,吳明貴,黃林,等.前列腺癌組織中HPV16/18 DNA表達變化及其意義[J].山東醫藥,2016,56(23):83-85.doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.028.

[13]Zambrano A,Kalantari M,Simoneau A,et al.Detection of human polyomaviruses and papilomaviruses in prostatic tissue reveals the prostate as a habitat for multiple viral infections[J].Prostate,2002,53(4):263-276.doi:10.1002/pros.10157.