HPV E6/E7 mRNA檢測對宮頸錐切術后ASC-US患者分流診斷的價值

張飛芳 葉麗燕

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，發病率居所有惡性腫瘤的第4位[1]。據WHO統計，2008年中國約有75 000例新發病例，約33 000例死于宮頸癌[2]。宮頸上皮內瘤變（CIN）是與宮頸癌發生、發展密切相關的一組癌前病變。近年來隨著宮頸癌篩查方式的發展以及人們對宮頸癌預防意識的普遍增強，高級別CIN（Ⅱ、Ⅲ級）和早期宮頸癌檢出率不斷增加。目前，宮頸錐切術是高級別CIN的主要診療手段，但術后仍存在5%～25%[3]的復發率及病灶殘留率，發展為宮頸癌的概率約為正常人的4～5倍[4]。不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASC-US）是宮頸錐切術后宮頸殘端常見的細胞學異常結果，有進一步發展為高級別CIN甚至宮頸癌的可能。對宮頸殘端ASC-US患者的分流處理是宮頸錐切術后隨訪處理中的爭論點。現對本院160例有完整隨訪臨床資料，并于宮頸錐切術后隨訪中宮頸殘端細胞學檢測結果為ASC-US的患者進行回顧性分析，探討人乳頭瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA檢測在宮頸錐切術后宮頸殘端ASC-US患者分流中的診斷價值。

1 對象和方法

1.1 對象 從2013年4月至2016年10月在本院婦產科行宮頸錐切術并經組織病理學確診為CINⅡ、Ⅲ級的4 832例患者中選取術后3、6、12、18和24個月隨訪門診復查液基細胞學技術（thinprep cytologic test，TCT）、高危型 HPV（HR-HPV）DNA、HPV mRNA E6/E7，且隨訪中細胞學檢查結果為ASC-US并行陰道鏡檢查及宮頸活檢的患者 160 例，年齡 23～64（41.3±7.5）歲。納入標準：（1）已婚非妊娠婦女；（2）年齡 21～70 歲；（3）無內科免疫系統疾病及使用相關藥物史；（4）無全子宮切除史，無化療及盆腔放療史；（5）初次錐切切緣陰性，術后病理結果無升級；（6）臨床隨訪資料完整。本研究經醫院倫理委員會批準和患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 TCT檢測 月經干凈3d后采集標本，使用TCT檢測專用刷插入患者宮頸管旋轉5周，停留10s，收集宮頸口及宮頸管脫落的上皮細胞，將刷頭置入裝有CytoRich細胞保存液的收集瓶中待檢。采用廣州安必平公司生產的TCT系統，全自動染色。按照2001年伯塞斯達系統（the Bethesda system，TBS）標準診斷為 ASC-US。

1.2.2 HR-HPV DNA檢測 月經干凈后采樣，采集標本前3d內禁止性生活。專門的HPV DNA取樣刷采集宮頸分泌物，應用PCR反向點雜交技術檢測HR-HPV DNA，包括 HPV 16、18、31、33、35、39、45、S1、52、56、58、59、66、68、73。嚴格按照HPV基因檢測試劑盒（深圳亞能生物技術有限公司）說明書操作，1種HR-HPV陽性即為陽性。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA拷貝數測定 使用專用刷在宮頸外口逆時針旋轉5周，停留10s，將得到的標本置

于標本保存管中。采用HPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒和QuantiVirusTM冷光儀（均由鄭州科蒂亞生物技術公司生產），結果經電腦軟件換算為拷貝數，以HPV E6/E7 mRNA拷貝數＜1copy/ml為陰性，≥1copy/ml為陽性。嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.2.4 陰道鏡檢查及宮頸活檢 由本院專職陰道鏡醫師用電子陰道鏡觀察，并于醋酸白試驗和碘試驗異常區行選擇性多點組織活檢或取宮頸3、6、9、12點行常規活檢，必要時加行宮頸管搔刮。病理報告方式：宮頸正常或炎癥、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級和宮頸癌。病理診斷為金標準，以CINⅡ＋級（包括CINⅡ級、CINⅢ級和宮頸癌）和CINⅢ＋級（包括CINⅢ級和宮頸癌）為研究終點，以CINⅡ-級（包括正常/炎癥和CINⅠ級）和CINⅢ-級（包括正常/炎癥、CINⅠ級和CINⅡ級）為對照組。

1.2.5 診斷標準 術后3～6個月內復查仍有CIN病變者為病變殘留；術后6個月內未發現CIN病變，但6個月后再次發現病變者，判定為CIN病變復發。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。非正態分布的計量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。以組織病理診斷結果為標準，分別計算HR-HPV DNA檢測與HPV E6/E7 mRNA檢測兩種隨訪方法的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及診斷正確率。相關性分析采用Spearman等級相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA檢測結果與病理診斷（金標準）比較 160例宮頸錐切術后殘端ASCUS患者中，HPV E6/E7 mRNA檢測陽性52例，陽性率為32.5%，其中有45例（86.5%）殘留/復發；HR-HPV DNA檢測陽性98例，陽性率為61.3%，其中67例（68.4%）殘留/復發；HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率低于HR-HPV DNA檢測陽性率，差異有統計學意義（P＜0.01）。CINⅡ-級HR-HPV DNA檢測陽性率明顯高于HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率，差異有統計學意義（P＜0.01）；但 CINⅡ＋級 HR-HPV DNA 與 HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；CINⅡ＋級與CINⅢ＋級的HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率比較差異無統計學意義 （P＞0.05）；CINⅡ＋級和CINⅢ＋級的HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率分別高于CINⅡ-級和CINⅢ-級，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。病理檢查結果與HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA檢測結果見表1。

表1 HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA檢測結果與病理診斷（金標準）比較[例（%）]

2.2HPV E6/E7 mRNA和HR-HPV DNA檢測對CINⅡ＋級病灶殘留/復發的診斷價值 HPV E6/E7 mRNA檢測的特異度、陽性預測值和診斷正確率均高于HR-HPV DNA檢測，差異均有統計學意義(均P＜0.05)；而兩種方法靈敏度和陰性預測值比較差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表 2。

表2 HPV E6/E7 mRNA和HR-HPV DNA檢測對CINⅡ＋級病灶殘留/復發的診斷價值

2.3 不同級別宮頸病變患者HPV E6/E7 mRNA拷貝數比較 不同級別宮頸病變患者HPV E6/E7 mRNA拷貝數比較差異有統計學意義（P＜0.01）。另有宮頸癌1例，其HPV E6/E7 mRNA拷貝數為38 935.28copies/ml。宮頸病變級別高的患者HPV E6/E7 mRNA拷貝數明顯增加，兩者呈正相關（r＝0.658，P＜0.01），見表 3。

表3 不同級別宮頸病變HPVE6/E7mRNA拷貝數比較（copies/ml）

3 討論

高級別CIN病灶具有多發、不連續的特點，患者經宮頸錐切術治療后進展為宮頸浸潤癌的概率較未經治療者顯著降低，但仍高于普通人群。病變殘留/復發與HR-HPV 感染[5-6]、錐切術切緣陽性[7-8]、多項限受累[9]、年齡[6，10]等因素相關。其中，術后6個月內HPV陽性是預測復發最重要的因素[5]。

ASC-US是宮頸錐切術后常見的細胞學異常結果，ASC-US可能是錐切術后細胞增生活躍的良性改變，也可能是進展為浸潤癌的惡性改變。因此，宮頸錐切術后ASC-US的分流管理一直是臨床工作中的難點與爭論點。2012年美國陰道鏡檢查與子宮頸病理學會（ASCCP）發布異常宮頸癌篩查和癌前病變的管理指南中指出[11]，CINⅡ/Ⅲ級患者宮頸錐切術后隨訪應在術后12和24個月行細胞學檢測及HPV聯合檢測，若聯合檢測皆為陰性，則36個月再次行聯合檢測，若任意一次結果出現異常，則推薦行陰道鏡檢查及宮頸組織活檢。若所有結果未見異常，則按常規篩查20年，即使超過65歲。國內宮頸癌及癌前病變規范化診療指南提出CIN患者應每3～6個月行細胞學檢查隨，連續3次正常可改為一年一次[12]。2016年美國婦產科醫師學會（ACOG）宮頸癌篩查指南則指出既往CINⅡ/Ⅲ級治療后患者需比常規篩查更頻繁的篩查[13]，均未詳細提及術后殘端ASC-US患者的管理。宮頸錐切術后存在病灶復發/殘留的概率，可能與HR-HPV活化及持續感染、病灶不連續、宮頸管深處存在病灶有關。本研究納入患者均為切緣陰性患者，術后殘端ASC-US患者發生病灶殘留/復發的概率為31.9%（51/160），較以往報道高，這與研究對象選擇不同有關，也提示殘端ASC-US患者需要更為嚴密的監測。

目前國內聯合篩查方式主要為TCT聯合HR-HPV DNA檢測。HR-HPV DNA檢測能判斷HPV感染狀態，但無法檢測病毒的活躍程度，無法準確評估病情進展。環形HPV基因線性隨機整合到宿主染色體后發生E6、E7基因非抑制性轉錄，其轉錄產物E6/E7 mRNA翻譯產生E6、E7癌蛋白，干擾2個關鍵性腫瘤抑制蛋白p53、pRB的功能并加速其降解，使感染細胞易于出現細胞周期失控、細胞增生及DNA突變累積而發生惡性轉化[14-15]。因此，目前認為HPV E6/E7 mRNA可反映與宿主細胞整合的HPV的活躍程度，可用于評估病情進展。一項納入8項研究的薈萃分析結果顯示[16]：在TCT結果為ASC-US及低度鱗狀上皮內病變（LSIL），并最終病理結果為CINⅡ＋級的患者中，HPV E6/E7 mRNA與HRHPV DNA相比較，兩者靈敏度相似，但HPV E6/E7 mRNA有更高的特異度。本研究對高級別CIN術后隨訪為 ASC-US的160例患者分析顯示：HPV E6/E7 mRNA檢測與HR-HPV DNA檢測CINⅡ＋級比較，HPV E6/E7 mRNA檢測特異度及陽性預測值分別為0.90、0.79，均明顯高于HR-HPV DNA檢測的0.49、0.43，但兩者靈敏度及陰性預測值比較差異無統計學意義，與此項薈萃分析結果一致。在一項針對中國人群的研究中也得到了同樣的結論[17]。相對于HR-HPV DNA檢測，HPV E6/E7 mRNA檢測作為分流指標，可降低陰道鏡轉診率，避免過多隨訪、過度檢查及治療，減少了醫療資源浪費和患者心理負擔。

本研究中宮頸錐切術后ASC-US患者CINⅡ+級和CINⅢ+級的HPV E6/E7 mRNA陽性率分別明顯高于CINⅡ-級和CINⅢ-級，表明隨著宮頸病變進展，HPV E6/E7 mRNA檢出率增加。且宮頸病變級別高的患者HPV E6/E7 mRNA拷貝數明顯增加，兩者呈正相關，提示HPV E6/E7 mRNA拷貝數可在一定程度上提示患者的宮頸病變組織學改變，這與報道的HPV E6/E7 mRNA用于宮頸癌篩查的結果相一致[18-19]。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA檢測作為宮頸錐切術后ASC-US患者的分流指標，相比HR-HPV DNA檢測具有高特異度，可以很好地預測術后病灶殘留/復發的風險，能減少陰道鏡轉診率的同時不降低高級別宮頸病變的檢出率，可以更精確地選擇高危人群，且可在一定程度上評估病變嚴重程度，具有較大的臨床應用前景，但仍需更多多中心、大樣本的實驗數據的支持。

[1]Zhang Q,Pan E,He Y,et al.Analyses on cancer incidence and mortality in Huai'an area,China,2010[J].Open J Prev Med,2014,4(6):504-512.doi:10.4236/ojpm.2014.46059.

[2]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CACancerJ Clin,2016,66(2):115-132.doi:10.3322/caac.21338.

[3]TornA,FustP,Rodrguez-Carunchio L,et al.Intraoperative post-conization human papillomavirus testing for early detection of treatment failure in patients with cervical intraepithelial neoplasia:a pilot study[J].BJOG,2013,120(4):392-399.doi:10.1111/1471-0528.12072.

[4]Lili E,Chatzistamatiou K,Kalpaktsidou-Vakiani A,et al.Low recurrence rate of high-grade cervical intraepithelial neoplasia after successful excision and routine colposcopy during follow-up[J].Medicine(Baltimore),2018,97(4):e9719.doi:10.1097/MD.0000000000009719.

[5]Leguevaque P,Motton S,Decharme A,et al.Predictors of recurrence in high-grade cervical lesions and a plan of management[J].Eur J Surg Oncol,2010,36(11):1073-1079.doi:10.1016/j.ejso.2010.08.135.

[6]劉莉,陳麗梅,陶祥,等.1502例子宮頸HSIL患者行LEEP錐切術后隨訪半年的臨床結局及術后病灶殘留的危險因素分析[J].中華婦產科雜志,2017,52(11):751-756.doi:10.3760/cma.j.issn.0529-567X.2017.11.007.

[7]Shaco-Levy R,Eger G,Dreiher J,et al.Positive margin status in uterine cervix cone specimens is associated with persistent/recurrent high-grade dysplasia[J].Int J GynecolPathol,2014,33(1):83-88.doi:10.1097/PGP.0b013e3182763158.

[8]Sand FL,Frederiksen K,Munk C,et al.Long-term risk of cervical cancer following conization of cervical intraepithelial neoplasia grade 3-ADanish nationwide cohort study[J].Int J Cancer,2017.doi:10.1002/ijc.31202.[Epub ahead ofprint]

[9]Guducu N,Sidar G,Bassullu N,et al.Endocervical glandular involvement,multicentricity,and extent of the disease are features of high-grade cervicalintraepithelialneoplasia[J].Ann Diagn Pathol,2013,17(4):345-346.doi:10.1016/j.anndiagpath.2013.04.002.

[10]Simes RB,Campaner AB.Post-cervicalconization outcomes in patients with high-grade intraepithelial lesions[J].APMIS,2013,121(12):1153-1161.doi:10.1111/apm.12064.

[11]Massad LS,Einstein MH,Huh WK,et al.2012 updated consensus guidelines for the management of abnormal cervical cancer screening tests and cancer precursors[J].Obstet Gynecol,2013,121(4):829-846.doi:10.1097/AOG.0b013e3182883a34.

[12]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.宮頸癌及癌前病變規范化診療指南(試行)[J].中國醫學前沿雜志(電子版),2013,5(8):40-49.doi:10.3969/j.issn.1674-7372.2013.08.010.

[13]Chelmow D.Cervicalcancer screening and prevention[J].Obstet Gynecol,2016,127(1):1-20.doi:10.1097/AOG.0000000000001263.

[14]Ren C,Zhu Y,Yang L,et al.Diagnostic performance of HPVE6/E7 mRNA assay for detection of cervical high-grade intraepithelial neoplasia and cancer among women with ASCUS Papanicolaou smears[J].Arch Gynecol Obstet,2018,297(2):425-432.doi:10.1007/s00404-017-4588-1.

[15]Doorbar J,Quint W,Banks L,et al.The biology and lift-cycle of human papillomaviruses[J].Vaccine,2012,20(30 Suppl 5):F55-70.doi:10.1016/j.vaccine.2012.06.083.

[16]Arbyn M,Roelens J,CuschieriK,et al.The APTIMA HPVassay versus the Hybrid Capture 2 test in triage ofwomen with ASC-US or LSIL cervical cytology:A meta-analysis of the diagnostic accuracy[J].Int J Cancer,2013,132(1):101-108.doi:10.1002/ijc.27636.

[17]Wang HY,Lee D,Park S,et al.Diagnostic performance of HPV E6/E7 mRNA and HPV DNA assays for the detection and screening of oncogenic human papillomavirus infection among woman with cervical lesions in China[J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(17):7633-7640.

[18]Qiu C,ZhiY,Shen Y,et al.Performance of the HPV-16 L1 methylation assay and HPVE6/E7 mRNA test for the detection of squamous intraepithelial lesions in cervical cytological samples[J].J VirolMethods,2015,224:35-41.doi:10.1016/j.jviromet.2015.08.008.

[19]Gage JC,KatkiHA,Schiffman M,et al.The low risk of precancer after a screening result of human papillomavirus-negative/atypical squamous cells of undetermined significance papanicolaou and implications for clinical management[J].Cancer Cytopathol,2014,122(11):842-850.doi:10.1002/cncy.21463.