花青素合成轉(zhuǎn)錄因子Vlmyb2遺傳轉(zhuǎn)化煙草的研究

孫婧文，呂立堂，趙德剛

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

花青素(anthocyanin)是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬于類黃酮類化合物，也是植物的主要呈色物質(zhì)。研究表明，攝入花青素能夠降低心血管疾病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎和癌癥的發(fā)病率[1-3]。花青素還有抗氧化、抗增生和減輕肝機(jī)能障礙及抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生等多種生理功能[4-5]。目前已從葡萄、擬南芥、矮牽牛、紫甘薯等植物中克隆了大量與花青素生物合成代謝相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因。Vlmyb2轉(zhuǎn)錄因子是花青素合成途徑中的調(diào)節(jié)基因，該基因通過調(diào)節(jié)花色素苷的合成來決定葡萄漿果的顏色[6]。花青素的生物活性研究已經(jīng)有很多成果，也有研究者嘗試在一些花青素含量比較低的植物中轉(zhuǎn)入花青素合成相關(guān)基因，增加花青素的表達(dá)，其結(jié)果是植株抗氧化能力得到了提升[7]。本次研究通過轉(zhuǎn)花青素合成轉(zhuǎn)錄因子Vlmyb2并對(duì)煙草生理特征進(jìn)行測(cè)定，探究Vlmyb2基因的表達(dá)對(duì)植株生長(zhǎng)的是否有影響。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料為煙草。質(zhì)粒主要包含有目的基因Vlmyb2和篩選基因NPTⅡ (新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)、GUS(β-葡萄糖苷酸酶基因)報(bào)告基因表達(dá)元件的植物表達(dá)載體，植物表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。農(nóng)桿菌菌株為EHA105。

1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化

采用葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化煙草。參照姚新轉(zhuǎn)等[7-8]煙草組織培養(yǎng)方法，直到抗性苗長(zhǎng)至4～5 cm時(shí)，移栽于營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)，期間不定期追肥。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)

經(jīng)卡那霉素篩選的煙草生長(zhǎng)至4～6葉期時(shí)，剪取葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，鑒定后，按照天根生化科技(北京)有限公司新型植物總DNA提取試劑盒步驟分別提取GUS染色陽性煙草和野生型煙草DNA，用于PCR鑒定[8]。

1.4 花青素相對(duì)含量的測(cè)定

參照張志良[9]的測(cè)定方法。

1.5 葉綠素含量的測(cè)定

參照張志良[9]的測(cè)定方法。

1.6 光合速率測(cè)定

選取轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株共計(jì)10株，每株測(cè)量從頂端往下第三片成熟葉片。選擇晴朗無風(fēng)的天氣，在上午9點(diǎn)～11點(diǎn)，利用美國(guó)Li-6400便攜式光合儀，選取植株頂端往下第三片全展成熟葉片測(cè)定其凈光和速率(Pn)、蒸騰速率(trmmol)、胞間CO2和氣孔導(dǎo)度(Cond)4個(gè)指標(biāo)，每片葉片測(cè)3個(gè)重復(fù)。

1.7 細(xì)胞學(xué)觀察

參照付洪蘭[10]的測(cè)定方法取生長(zhǎng)60 d左右的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草煙草成熟葉片做細(xì)胞學(xué)觀察，轉(zhuǎn)基因和野生型各選取3株，每株3個(gè)重復(fù)，在樣品觀察時(shí)每個(gè)重復(fù)選取5個(gè)視野，用5-3400N掃描電鏡對(duì)煙草葉片表面腺毛形態(tài)、腺毛密度進(jìn)行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及PCR鑒定

對(duì)33株煙草抗性植株的葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示抗性植株葉片顯現(xiàn)藍(lán)色，而非轉(zhuǎn)基因植株葉片并未染出藍(lán)色(圖1)。對(duì)GUS呈陽性的植株進(jìn)行Vlmyb2基因的PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，質(zhì)粒對(duì)照和抗性植株均能擴(kuò)增得到419 bp的特異條帶，非轉(zhuǎn)基因植株沒有擴(kuò)增出特異條帶(圖2)，說明外源基因已經(jīng)整合到煙草基因組中，初步證明獲得了轉(zhuǎn)Vlmyb2基因煙草植株。

注：WT：野生型煙草；TP：轉(zhuǎn)基因煙草；

注： M： DL1000; WT： 陰性對(duì)照; P： 質(zhì)粒陽性對(duì)照;1～5： 不同抗性植株

2.1 花青素含量的測(cè)定

以野生型煙草植株作為對(duì)照，選取轉(zhuǎn)V1myb2基因的煙草植株8個(gè)不同株系進(jìn)行花青素含量的測(cè)定。轉(zhuǎn)Vlmyb2基因煙草的花青素的表達(dá)量與野生型植株相比有了較大的提高。不同株系的花青素表達(dá)量不同，其中花青素含量高的植株TP4、TP5和TP7是野生型的284～288倍左右。花青素含量中等的植株TP2、TP3 和TP6是對(duì)照植株的92～146倍，花青素含量低的植株TP1和TP8是野生型植株的2.55和6.77倍。

2.2 花青素含量的測(cè)定

以野生型煙草植株作為對(duì)照，選取轉(zhuǎn)Vlmyb2基因的煙草植株8個(gè)不同株系進(jìn)行花青素含量的測(cè)定。轉(zhuǎn)Vlmyb2基因煙草的花青素的表達(dá)量與野生型植株相比有了較大的提高。不同株系的花青素表達(dá)量不同，其中花青素含量高的植株TP4、TP5和TP7是野生型的284～288倍左右。花青素含量中等的植株TP2、TP3 和TP6是對(duì)照植株的92～146倍，花青素含量低的植株TP1和TP8是野生型植株的2.55和6.77倍。

2.3 轉(zhuǎn)Vlmyb2 基因?qū)煵萑~片中葉綠素含量的影響

由圖3和圖4可知：花青素含量高的TP4，TP5和TP7，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，其葉綠素總含量在0.8775～1.048 mg/g之間，是所有株系中葉綠素含量中最低的3株。而葉綠素含量較大的WT和TP8株系中，其花青素相對(duì)含量低于0.1，為所有株系中較低的。由此可知，花青素的積累總是伴隨著葉綠素含量的降低，這與劉國(guó)君[10]在研究小蘋果不同季節(jié)、不同時(shí)期的葉綠素，花青素含量的結(jié)果一致。受到花青素影響較大的是葉綠素a，而葉綠素b的含量影響不大，葉綠素a作為反應(yīng)中心色素的只是很少一部分。

注：WT：野生型煙草；TP：轉(zhuǎn)基因煙草；

綜上，本次試驗(yàn)中，在花青素相對(duì)含量高于0.494，葉綠素含量低于1.329 mg/g的植株中，花青素與葉綠素呈現(xiàn)出較為明顯的線性反比關(guān)系。而當(dāng)花青素含量低于0.494，葉綠素含量高于1.329 mg/g時(shí)這種關(guān)系并不明顯。

2.4 轉(zhuǎn)Vlmyb2基因?qū)煵萑~片光合作用的影響

轉(zhuǎn)花青素轉(zhuǎn)錄因子Vlmyb2后的植株葉綠素含量受到了影響，而葉綠素又是植物光和作用途徑中重要的一類物質(zhì)。為了探究葉片中葉綠素含量降低后是否對(duì)植株的光和作用是否有影響，使用美國(guó)Li-6400便攜式光合儀對(duì)植株的凈光和速率(Pn)、蒸騰速率(trmmol)、氣孔導(dǎo)度(Cond)和胞間CO2四個(gè)指標(biāo)(圖5～圖8)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)錄因子花青素的超表達(dá)對(duì)煙草葉片的光合速率有一定的影響。由于不同株系間存在著差別，從總體的趨勢(shì)來看，轉(zhuǎn)基因煙草葉片的凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均低于野生型葉片，而胞間CO2的濃度稍高于對(duì)照葉片，所以轉(zhuǎn)基因植株的光合效率低于野生型植株。但是，從測(cè)定數(shù)據(jù)上來看，不同株系間光合效率存在著差異，有的株系與野生型煙草相比變化并不明顯或者沒有變化，說明Vlmyb2基因調(diào)節(jié)花青素結(jié)構(gòu)基因在煙草中超表達(dá)會(huì)降低植株的光合效率，但降幅并不顯著，對(duì)植株正常生長(zhǎng)沒影響。

注：WT：野生型煙草；TP：轉(zhuǎn)基因煙草；

圖5 轉(zhuǎn)Vlmyb2基因?qū)煵萑~片凈光合速率的影響Fig.5 Effect of Vlmyb2 gene on net photosynthetic rate >of Vlmyb2 transgenic tobacco leaves

圖6 轉(zhuǎn)Vlmyb2基因?qū)煵萑~片氣孔導(dǎo)度的影響
Fig.6 Effect ofVlmyb2 gene on stomatal conductance of transgenic tobacco leaves

圖7 轉(zhuǎn)Vlmyb2基因?qū)煵萑~片胞間CO2濃度的影響Fig.7 Effect of Vlmyb2 gene on intercellular CO2concentration of transgetic tobacco leaves

圖8 轉(zhuǎn)Vlmyb2基因?qū)煵萑~片蒸騰速率的影響Fig.8 Effect of Vlmyb2 gene on transpiration rate of transgenie tobacco leaves

2.5 煙草腺毛的細(xì)胞學(xué)分析

葉面腺毛是葉片表皮細(xì)胞特化而來的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，采用掃描電鏡對(duì)轉(zhuǎn)基因的植株與對(duì)照的纖毛數(shù)量觀察。結(jié)果如下：反面腺毛多于正面腺毛(表1)，這與李鵬飛[11]的研究成果相符合。花青素含量高的植株(圖9A)，不論正面還是背面，其密度都高于WT約23%，差異達(dá)到顯著性。而花青素中等含量的植株TP3與對(duì)照的水平相當(dāng)，相差不超過5%(圖9B和圖10B)。花青素含量低的植株TP1的植株其腺毛密度又低于對(duì)照組大約15%。這表明，轉(zhuǎn)錄因子Vlmyb2花青素的表達(dá)對(duì)煙草葉片腺毛的密度產(chǎn)生了的影響，高表達(dá)V1myb2基因促進(jìn)腺毛數(shù)量的增加，低表達(dá)Vlmyb2基因腺毛數(shù)量減少。

表1 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草單位面積內(nèi)腺毛根數(shù)平均值Tab.1 The average value of wild type and transgenic tobacco glandular hairs within the unit area

注：A：野生型；B，C，D：轉(zhuǎn)基因

注：A，B，C：轉(zhuǎn)基因；D：野生型

3 結(jié)論與討論

長(zhǎng)期以來，光和色素的含量被認(rèn)為與光和速率有直接的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn)葉綠素的含量很低的植株光和速率沒有低于對(duì)照太多，有以下幾種可能：首先，受到花青素表達(dá)影響的大多是葉綠素a，而葉綠素b含量受到的影響不大，葉綠素a作為反應(yīng)中心色素的只是很少一部分。根據(jù)許曉明等[12]的研究，可以認(rèn)為花青素的表達(dá)并沒有影響到反應(yīng)中心色素。甚至有可能是促進(jìn)了電子的傳遞，因而光和速率并沒有受到太大的影響。進(jìn)行測(cè)定的時(shí)間是在當(dāng)日的11點(diǎn)左右，氣溫已經(jīng)很高，并且光照很強(qiáng)。因此可能部分植株的光和速率已經(jīng)開始受到抑制，而根據(jù)王美玲等[13]研究，葉片中的花青素有抵御高溫的作用，因此，可以認(rèn)為花青素表達(dá)高的植株的光和速率還沒有受到抑制。而花青素表達(dá)量低的植株則已經(jīng)受到了高溫的抑制，導(dǎo)致光和速率下降。所以出現(xiàn)了花青素含量高的植株光和速率與對(duì)照差別不大的情況。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，Vlmyb2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)煙草的腺毛數(shù)量有所影響，表達(dá)量高的植株腺毛數(shù)量得到了提升。試驗(yàn)采用的材料在品種上相同，因此排除了腺毛密度不同是由于品種問題。試驗(yàn)材料在農(nóng)場(chǎng)生長(zhǎng)的過程中所有植株的環(huán)境一樣，所以也排除了環(huán)境因素的影響。劉翔等[14]研究表明，myb類轉(zhuǎn)錄因子與植株的腺毛生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，myb類轉(zhuǎn)錄因子的過量可以促進(jìn)腺毛發(fā)育起始，產(chǎn)生異位腺毛，從而增加腺毛數(shù)量；同時(shí)也存在著減少腺毛生長(zhǎng)的能力。因此推測(cè)，Vlmyb2轉(zhuǎn)錄因子同樣對(duì)腺毛的發(fā)育產(chǎn)生了影響，Vlmyb2的高表達(dá)促進(jìn)腺毛發(fā)育。利用基因工程創(chuàng)制富含花青素的煙草新品種具有重要意義，但轉(zhuǎn)錄因子Vlmyb2 也引起了一些負(fù)效應(yīng)，如降低煙草植株光合效率等，但這些變化并不是很明顯。

通過本研究，Vlmyb2基因的表達(dá)可以對(duì)煙草的花青素合成起調(diào)節(jié)作用，為創(chuàng)造花青素高含量的煙草奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Prior R L, Wu X. Anthocyanins： structural characteristics that result in unique metabolic patterns and biological activities[J].FreeRadicalResearch, 2006, 40(10):1014-1028.

[2] Springob K, Nakajima J, Yamazaki M,etal. Recent advances in the biosynthesis and accumulation of anthocyanins[J].Cheminform, 2003, 34(38):288.

[3] Bagchi D, Sen C K, Bagchi M,etal. Anti-angiogenic, antioxidant, and anti-carcinogenic properties of a novel anthocyanin-rich berry extract formula.[J].BiochemistryBiokhimiia, 2004, 69(1):75-80.

[4] 方忠祥, 倪元穎. 花青素生理功能研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2001, 17(3):60-62.

[5] Ding M, Feng R, Wang S Y,etal. Cyanidin-3-glucoside, a natural product derived from blackberry, exhibits chemopreventive and chemotherapeutic activity[J].JournalofBiologicalChemistry, 2006, 281(25):17359.

[6] Kobayashi S, Ishimaru M, Hiraoka K,etal. Myb-related genes of the Kyoho grape (Vitis labruscana) regulate anthocyanin biosynthesis[J].Planta, 2002, 215(6):924.

[7] 趙 岑, 呂立堂, 趙德剛. 花青素調(diào)節(jié)基因VlmybA2對(duì)番茄遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2012, 31(3):270-275.

[8] 姚新轉(zhuǎn), 呂立堂, 趙德剛.轉(zhuǎn)PSAG12-BAS1基因抑制煙草葉片的衰老[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 24(12):1831-1838.

[9] 張志良.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社, 1990：190-191.

[10] 付洪蘭.實(shí)用電子顯微鏡技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社, 2004:40-58.

[11] 李鵬飛，周冀衡，邵 巖，等.不同烤煙品種成熟過程中各類腺毛密度的變化[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，31(2)；133-137.

[12] 許曉明, 張榮銑, 唐運(yùn)來. 低葉綠素含量對(duì)突變體水稻吸收光能分配特性的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 37(3):339-343.

[13] 王美玲, 艾希珍, 丁 飛,等. 紫甘藍(lán)和普通甘藍(lán)光合特性的比較[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2008, 35(4):547-552.

[14] 劉 翔, 左開井, 張 飛,等. MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物腺毛發(fā)育中的作用研究進(jìn)展[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版), 2010, 28(2):96-102.