藥用植物三尖杉及其同屬易混物種的DNA條形碼鑒定研究＊

黃宇航，曾卓爾，成 航，鄧 港，駱帥賓，麥倩婷，高 翰，劉 霞＊＊

（1.武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院 武漢 430070;2.武漢市外國語學(xué)校高中部 武漢 430022）

三尖杉Cephalotaxus fortunei Hook.f.是一種藥用植物，我國民間將其帶嫩枝的葉作為消積、潤肺和驅(qū)蟲藥[1]。三尖杉廣泛分布于秦嶺以南的部分省區(qū)，垂直分布從東（約200 m）到西（2 500 m）逐漸升高。一般常與闊葉樹、針葉樹混雜，呈零星分布[2,3]。三尖杉中含有生物堿和黃酮兩大類化學(xué)成分[4]，其中三尖杉酯類生物堿具有抗癌活性[5]。20世紀(jì)70年代初，Powell等發(fā)現(xiàn)三尖杉中的三尖杉酯堿類化合物具有抑制小鼠白血病細(xì)胞生長的作用，從而引起人們對其生物堿類成分的廣泛研究和重視[6-9]。目前，我國已將三尖杉酯堿（harringtonine,HT）和高三尖杉酯堿（homoharringtonine,HHT）開發(fā)成抗癌藥物，對急性非淋巴細(xì)胞性白血病和慢性粒細(xì)胞性白血病有較好療效[10,11]。由于其抗癌功效良好，三尖杉已被過度商業(yè)采伐，目前處于漸危狀態(tài)并且種群數(shù)量正在下降[12,13]。

由于三尖杉的藥用部位主要為葉，與其他同屬近緣物種形態(tài)極其相似[14]，使得利用形態(tài)特征對三尖杉進行快速、有效鑒別稍顯困難[15]。同時，郎學(xué)東等[16,17]提出對于三尖杉屬植物的系統(tǒng)分類尚存爭議，這使得利用已有文獻對三尖杉進行形態(tài)學(xué)鑒定變得更為復(fù)雜。經(jīng)過走訪市場發(fā)現(xiàn)，其最常見的同屬易混物種為粗榧Cephalotaxus sinensis(Rehd.et Wils.)Li和蓖子三尖杉Cephalotaxus oliveri Mast.。市場上流通的混淆物種會威脅三尖杉的用藥安全。目前，針對三尖杉屬植物的鑒別方法除有形態(tài)學(xué)鑒別外，還有顯微鑒別[18]和薄層色譜分析[19]等。上述方法均存在不同程度的局限性。所以需要探索一種針對三尖杉及其易混物種高效、快捷的新型鑒定方法。

DNA條形碼技術(shù)是一種利用基因中相對較短的特異性序列來進行物種分類學(xué)鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)[20]。該技術(shù)與傳統(tǒng)鑒定技術(shù)相比，在物種鑒別時具有高穩(wěn)定性、高準(zhǔn)確性的特點[21]，對于保障中藥材用藥安全準(zhǔn)確具有重要意義[27]。目前，該技術(shù)已經(jīng)在植物系統(tǒng)學(xué)分類等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并已成功應(yīng)用于蔓荊子、車前子、羌活等多種中藥材的鑒別中[22-26]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)運用DNA條形碼技術(shù)鑒定三尖杉的相關(guān)報道。本研究基于DNA條形碼技術(shù)，探索ITS2和psbA-trnH序列作為三尖杉及其屬內(nèi)易混物種條形碼序列的可行性，以規(guī)范三尖杉藥材的選用，保障其用藥安全。

表1 采集樣品信息表

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗通過野外考察等方式收集三尖杉屬3個物種（三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉）共22份植物樣本，其中三尖杉6份、粗榧8份、蓖子三尖杉8份，分別來自湖北、云南等地。所有樣品均經(jīng)武漢理工大學(xué)樓一層教授鑒定，憑證標(biāo)本保存在武漢理工大學(xué)中藥資源與分子鑒定實驗室。詳細(xì)樣品信息見表1。本研究另從GenBank數(shù)據(jù)庫下載上述3物種psbA-trnH序列共10條，Genbank登錄號見表2。

表2 psbA-trnH下載序列信息表

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

參照中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[28,29]，取經(jīng)硅膠干燥的樣品葉片約20 mg，經(jīng)75%乙醇擦拭后，用高通量組織研磨儀（Sceintz-48，寧波新芝）以30次/min研磨2 min。利用核分離液（2%PVP，20 mmol?L-1EDTA，100 mmol?L-1PH 8.0 Tris-HCl和0.7 mol?L-1NaCl）800 μL抽提2次后，利用基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.,China）提取DNA。

1.2.2 PCR擴增及測序

ITS2和psbA-trnH序列PCR擴增引物及反應(yīng)條件參見《中藥DNA條形碼分子鑒定》[29]，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測并對有清晰目的條帶的樣品進行純化后，使用ABI 3730XL測序儀（Applied Biosystems Co.,USA）進行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

利 用 CodonCode AlignerV4.2（CodonCode Co.,USA）對測序峰圖文件進行序列拼接和剪切，去除低質(zhì)量部分。將所得序列采用基于隱馬爾科夫模型HMMer注釋的方法，在ITS2 database網(wǎng)站進行注釋，剪去所得序列的5.8S端和28S端，獲得ITS2序列[30-32]。通過與Genbank序列進行Blast比對，并利用參考序列進行注釋，獲得psbA-trnH序列。使用MEGA 5.1（Molecular Evolutionary Genetics Analysis Co.,USA）軟件進行序列比對分析[33]。分別基于兩種序列，利用K2P（Kimura 2-Parameter）模型計算各物種遺傳距離并分析，構(gòu)建Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)聚類樹，并采用bootstrap重復(fù)1 000次對各分支的支持率進行檢驗[33]。

2 結(jié)果

2.1 三尖杉及其同屬易混物種的種內(nèi)變異分析

2.1.1 基于ITS2序列的種內(nèi)變異分析

三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉的ITS2序列特征見表3。三尖杉共6條序列，長度均為233 bp，以SJ-001為主導(dǎo)單倍型。在132 bp處存在A-C變異；152 bp處存在C-T變異；161 bp處存在T-C變異；175 bp處存在CG變異。平均GC含量為69.30%。粗榧共8條序列，長度為223-237 bp，存在分別以CF-001、CF-003為主導(dǎo)單倍型的2種單倍型。在108 bp處存在G-A變異；在117 bp處存在A-G變異。平均GC含量為66.75%。蓖子三尖杉共8條序列，長度為223-233 bp，存在分別以BZ-001、BZ-007為主導(dǎo)單倍型的2種單倍型。在235 bp處存在A-C變異。平均GC含量為69.50%。

表3 三尖杉及其同屬易混物種ITS2序列特征表

表4 三尖杉及其同屬易混物種psbA-trnH序列特征表

2.1.2 基于psbA-trnH序列的種內(nèi)變異分析

三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉的psbA-trnH序列特征見表4。三尖杉共10條序列，長度為313-390 bp，以SJ-001為主導(dǎo)單倍型。不存在種內(nèi)變異位點。平均GC含量為39.90%。粗榧共12條序列，長度為390-490 bp，存在分別以CF-003、CF-005為主導(dǎo)單倍型的2種單倍型。存在99個種內(nèi)變異位點。平均GC含量為41.10%。蓖子三尖杉除BZ-007擴增失敗，共獲得9條序列，長度為268-364 bp，以BZ-001為主導(dǎo)單倍型。不存在種內(nèi)變異位點。平均GC含量為40.00%。

2.2 三尖杉及其同屬易混物種的種內(nèi)及種間遺傳距離計算

2.2.1 基于ITS2序列的遺傳距離計算

基于ITS2序列，利用K2P模型計算所得的遺傳距離見表5。三尖杉的最大種內(nèi)遺傳距離（0.0087）小于與粗榧的最小種間遺傳距離（0.7424）、小于與篦子三尖杉的最小種間遺傳距離（0.7424），表明可利用ITS2序列將三尖杉與這兩個易混物種區(qū)分。

2.2.2 基于psbA-trnH序列的遺傳距離計算

基于psbA-trnH序列，利用K2P模型計算所得的遺傳距離見表6。由于三尖杉和粗榧的最小種間距離為0，與三尖杉種內(nèi)遺傳距離相等，表明利用psbA-trnH序列無法區(qū)分三尖杉和粗榧兩物種。

2.3 NJ系統(tǒng)聚類樹構(gòu)建

2.3.1 基于ITS2序列的NJ樹

應(yīng)用相似性搜索法，構(gòu)建了基于ITS2序列的NJ系統(tǒng)聚類樹，見圖1。圖中三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉各自聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性。表明利用ITS2序列作為DNA條形碼，可以對三尖杉與其易混物種進行有效鑒定。

2.3.2 基于psbA-trnH序列的NJ樹

基于psbA-trnH序列所構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類樹見圖2。圖中三尖杉雖與蓖子三尖杉分開，但與粗榧聚為一支。表明利用psbA-trnH序列作為DNA條形碼，無法對三尖杉與其兩個易混物種進行鑒定。

表5 基于ITS2序列的三尖杉及其同屬易混物種遺傳距離信息表

表6 基于psbA-trnH序列的三尖杉及其同屬易混物種遺傳距離信息表

3 討論

DNA條形碼技術(shù)作為在生物分類和鑒定領(lǐng)域一項發(fā)展迅速的新技術(shù)，在保障藥用植物用藥安全和保護瀕危物種等方面具有潛力。本研究基于三尖杉及其2個易混物種共53條序列（ITS2序列22條、psbA-trnH序列31條）進行比對分析，探索利用DNA條形碼技術(shù)用于鑒定藥用植物三尖杉的可行性。

通過ITS2序列分析發(fā)現(xiàn)，三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉的序列種內(nèi)變異均較小，作為DNA條形碼具有良好的穩(wěn)定性。三尖杉ITS2序列種內(nèi)最大K2P遺傳距離小于與易混物種的種間最小K2P遺傳距離；基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹表明三尖杉能與其易混物種明顯區(qū)分。而三尖杉的psbA-trnH序列種內(nèi)最大K2P遺傳距離等于其與易混物種的種間最小K2P遺傳距離；基于psbA-trnH序列構(gòu)建的NJ樹顯示三尖杉無法單獨聚為一支。因此，ITS2序列可以作為有效鑒定三尖杉及其易混物種的合適DNA條形碼序列，而psbA-trnH序列不適合用于三尖杉及其易混物種的鑒定。確定ITS2序列作為鑒定三尖杉的DNA條形碼，對于保障其用藥安全和準(zhǔn)確性都有一定的意義[34]，同時也為其他近緣藥用植物的鑒定提供了思路和經(jīng)驗。

圖1 基于ITS2序列的NJ系統(tǒng)聚類樹

圖2 基于psbA-trnH序列所構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類樹

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