亞側耳遺傳多樣性的ISSR和SRAP綜合分析

劉夢雪， 榮成博， 牛玉蓉， 宋 爽， 劉 宇， 陳青君

(1.北京農學院植物科學技術學院農業應用新技術北京市重點實驗室，北京 102206；2.北京市農林科學院植物保護環境保護研究所/北京市食用菌工程技術研究中心，北京 100097)

亞側耳(Hohenbueheliaserotina)，別稱元蘑、凍蘑、黃蘑等，隸屬于真菌門擔子菌亞門層菌綱傘菌目白蘑科側耳屬。亞側耳富含蛋白質、氨基酸、多種不飽和脂肪酸和微量元素，是一種高蛋白、低脂肪的健康食品。亞側耳分布于河北、黑龍江、吉林、廣西、陜北、四川等地，在吉林長白山區自然分布較多，是東北地區著名的土特產[1]。由于長期大量采摘，亞側耳野生存留量已逐年減少[2]。

食用菌種質資源是優良品種育種的基礎材料，育種成效除了取決于所掌握種質資源的數量，還在很大程度上取決于對這些種質資源多樣性的遺傳特性的掌握。分子標記作為食用菌遺傳多樣性研究中的一個重要手段，其應用越來越廣泛[3]。

簡單重復序列區間(inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR)是由Zietkiewicz等于1994年創建的一種DNA標記技術[4]，結合了隨機擴增多態性DNA(random amplification polymorphic DNA，簡稱RAPD)和簡單重復序列(simple sequence repeats，簡稱SSR)方法的優點，是一種具有穩定性和高重復性的分子標記方法，被廣泛應用于食用菌方向。馮偉林等利用11個ISSR引物對12個杏鮑菇生產性菌株基因組DNA進行PCR擴增，發現利用ISSR分子標記技術能夠將杏鮑菇菌株區分開，并將12個杏鮑菇菌株聚為3個群，清晰地揭示了杏鮑菇菌株間的遺傳關系[5]。

序列相關擴增多態性(sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP)是一種由美國加州大學Li等應用的分子標記技術[6]，該技術利用上游引物針對外顯子區域，下游引物針對內含子區域、啟動子區域進行特異性擴增，上游引物和下游引物自由結合，配對出不同的組合進行反應。許峰等利用9對SRAP引物對22個白色金針菇進行聚類分析，在相似系數為0.820水平時，將供試菌株分為五大類，此技術揭示了北京地區金針菇菌株的遺傳多樣性[7]。

由于每個方法的開發原理不同，聚類分析結果通常會存在較大的差異，將多個分子標記綜合運用能最大地優化聚類分析結果[8]。劉婧宇等運用ISSR、RAPD和SRAP對26株香菇進行聚類分析，綜合分析結果表明，供試菌株間的遺傳相似系數范圍為0.49～0.97，在相似系數為0.61時，將26株香菇分為3個類群[8]。

筆者所在實驗室對全國范圍內收集到的亞側耳菌株進行收集、保存，通過ISSR和SRAP分子標記綜合分析，對19個亞側耳菌株進行遺傳多樣性研究，以期為雜交育種中親本的選擇和種質資源保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 試驗材料 本研究所用菌株的名稱及來源見表1。

1.1.2 試劑及培養基 馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉(BD Difco)、蛋白胨(OXIOD)、維生素B1、分析純磷酸二氫鉀、硫酸鎂等化學試劑，均購自國藥集團北京化學試劑有限公司；2×TaqPCR MasterMix，購自北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖，購自西班牙Biowest公司；所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon)合成。

PDA綜合培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3 g、蛋白胨5 g、維生素B110 mg，加水至1 000 mL。

表1供試菌株及其來源

1.1.3 儀器 主要儀器包括PCR儀(Eppendorf Mastercycler Gradient)、凝膠成像系統(Bio-Rad)、紫外-可見分光光度計(Labtech UV9100)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司，DYY-Ⅲ-12B)、電子分析天平(奧豪斯儀器上海有限公司)、臺式高速冷凍離心機(Eppendorf 5415R)、移液器(Eppendorf)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 ISSR和SRAP分析 取在PDA平板上活化7～10 d的亞側耳菌種，刮取少量菌絲作為試驗材料，DNA的提取參照許峰等的方法[9]，ISSR擴增反應體系及擴增程序參照馮偉林等的方法[10]；SRAP擴增反應體系及擴增程序參照邊銀丙等的方法[11]，所用引物見表2、表3。取7 μL PCR擴增產物，按2%的量加入SYBR Safe DNA Gel Stain(Invitrogen)進行瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外凝膠成像系統上觀察并拍照記錄。

表2ISSR分析用引物

1.2.2 數據處理及分析 在同一水平上將擴增出的強帶或可分辨性好的弱帶均視為擴增陽性，并賦值“1”，將未擴增出的條帶視為擴增陰性，賦值“0”，用NTSYSpc 2.10軟件進行聚類分析。

表3SRAP分析用引物

2 結果與分析

2.1 供試菌株ISSR分析結果

以菌株JZB2121009、JZB2121011、JZB2121017為模板，篩選出13條擴增條帶穩定、清晰、重復性好的ISSR引物(表2)。以提取的19個供試亞側耳菌株的基因組DNA為模板，使用經過對不同引物的PCR擴增篩選獲得的13條引物(表2)，在供試菌株上PCR產物的電泳效果較好，每個菌株都可以通過PCR擴增出DNA條帶，且條帶穩定、清晰、重復性好、分布合理。13條引物共擴增出154條DNA片段，其中多態性條帶數為145個，平均多態性為94.2%(表4)。由圖1可以看出，不同引物擴增出的DNA條帶數不等，其序列長度多為200～5 000 bp，其中包含了豐富的DNA多態信息。

2.2 供試菌株的SRAP分析結果

以提取的19個供試亞側耳菌株的基因組DNA為模板，使用經過不同引物的PCR擴增篩選獲得的13對引物(表3)，在供試菌株上PCR產物的電泳效果較好，每個菌株都可以通過PCR擴增出DNA條帶，且條帶穩定、清晰、重復性好、分布合理。13對引物共擴增出147條DNA片段，其中多態性條帶數為140條，平均多態性為94.5%(表5)。

表4ISSR多態性

表5SRAP多態性

由圖2可見，不同引物擴增出的DNA條帶數不等，其序列長度大多為200～5 000 bp，其中包含了豐富的DNA多態信息。

2.3 供試菌株聚類分析結果

綜合26條(對)引物擴增出的301條DNA片段，其中多態性條帶285條，多態性達94.7%。用NTSYSpc 2.10軟件對19個亞側耳供試菌株進行聚類分析，獲得各菌株間的聚類結果(圖3)。

3 結論與討論

筆者收集了不同地區的19個亞側耳菌株，并對其基因組DNA進行ISSR、 SRAP擴增和遺傳多樣性分析。聚類分析結果顯示，19株亞側耳菌株間的遺傳相似系數范圍為0.67～0.85。在相似系數為0.70時，可將19個供試菌株分為五大類。

聚類分析結果顯示，4號、5號、12號和15號菌株均來自白河自然保護站的同一海拔、同一區域，在聚類分析結果中也聚為一簇，說明品種存在一定的地域性；野生馴化種18號、19號菌株與野生采集種14號菌株親緣關系較近，說明18和19號菌株可能都是由同一個品種選育獲得的，且原始菌株與14號菌株為相近或相同品種；2號、17號菌株是來自相同地區的相同菌株，二者親緣關系很近，甚至可能同物異名，目前的聚類分析手段暫不能區分，有待用更多的引物進一步進行篩選或利用其他分子標記方法辨別；同樣來自白河自然保護站的14個菌株中，1號、2號、6號、8號、9號、12號和17號菌株均采集于椴樹倒木上，3號、4號、5號、11號、12號、14號和15號菌株均采集于蒙古櫟倒木上。聚類分析結果顯示，品種間親緣關系與其生長的環境并沒有直接聯系。

目前國內利用分子標記技術對雙孢菇[12]、金針菇[13]、杏鮑菇[14]和黑木耳[15]等進行遺傳多樣性分析的報道較多，但卻暫無對亞側耳品種進行遺傳多樣性分析的報道。本研究對全國范圍內收集的19個亞側耳菌株進行了遺傳多樣性的系統分析，對現有種質資源遺傳多樣性進行評價，為下一步選取遺傳差異較大的亞側耳菌株進行雜交育種工作打下了基礎。

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