蜘蛛粉中糖胺聚糖提取工藝的優(yōu)化

桑 曉，韓海燕，王彥多，劉 穎，曹廣超，王 靜，黃志強(qiáng)，方 園，毛會(huì)秀，王集會(huì)

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355；3.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

蜘蛛又名網(wǎng)蟲(chóng)、園蛛、扁蛛、盤(pán)絲仙，是蜘蛛目所有種的統(tǒng)稱(chēng)[1]。據(jù)相關(guān)期刊報(bào)道，目前全球確定的蜘蛛種類(lèi)大約有4萬(wàn)種，其中在中國(guó)已經(jīng)確定的大約4000種[2]。蜘蛛分布較廣，適應(yīng)性較強(qiáng)，大多數(shù)的蜘蛛具有毒腺，蜘蛛毒素能有效殺死癌細(xì)胞。據(jù)文獻(xiàn)資料顯示，蜘蛛具有較高的藥用價(jià)值。據(jù)《雷公炮炙論》記載，蜘蛛去除頭、足，然后研如膏，便可和其他中藥材一起治療疾病。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，蜘蛛性甘、微苦、微寒、有毒、歸肝經(jīng)，具有祛風(fēng)、消腫、解毒、消腫瘤、散結(jié)等效用。現(xiàn)今蜘蛛作為藥材使用，主要治療毒蟲(chóng)咬傷，腎陽(yáng)虧損，中風(fēng)口斜、鼻炎、脫肛、肺結(jié)核[5]等癥。

糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)又被稱(chēng)為黏多糖[6],因其溶解度多具有較高粘度而得名[7]，是普遍存在于動(dòng)物體內(nèi)，植物中也有發(fā)現(xiàn)的復(fù)合多糖[8-10]。糖胺聚糖分子中含有糖醛基和氨基糖殘基[11-12]，并由于糖胺聚糖含羧基比例較高，且多含硫酸基，具有較強(qiáng)的酸性，也稱(chēng)酸性黏多糖[13]。糖胺聚糖具有多種藥理作用，能促進(jìn)傷口愈合，能提高機(jī)體免疫能力，而且多數(shù)不具有毒副作用，是比較理想的藥物成分[14-15]。糖胺聚糖具有抗凝血、抗血栓、降血脂、抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤[16]、抗衰老、預(yù)防骨質(zhì)疏松等藥用價(jià)值，在生物藥物新藥研發(fā)中日益受到人們的青睞[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)采用紫外可見(jiàn)分光光度法,以蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取量為指標(biāo)[18]，以料液比、提取溫度、提取時(shí)間為試驗(yàn)因素[19-21]，通過(guò)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)來(lái)探討糖胺聚糖的最佳提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器設(shè)備

UV9100B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)；康世潔PL-S20小型超聲波清洗機(jī)(東莞康世潔超聲波科技有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；FA1004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；HWI電熱恒溫水溫箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱(上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；雷磁PHS-25 數(shù)顯pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

硫酸軟骨素對(duì)照品(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)：9007-28-7)，氫氧化鈉，胰蛋白酶，硫酸，無(wú)水乙醇，磷酸，石油醚，等試劑均為分析純。

1.3 供試品

蜘蛛粉(從河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高德民副教授鑒定為圓蛛科圓網(wǎng)蛛屬大腹園蛛Arunea ventricosa(L.Koch))。

2 試驗(yàn)方法

2.1 阿利新藍(lán)溶液的制備

精密稱(chēng)取0.1100 g阿利新藍(lán)8GX，加入到0.15 g·mL-1H3PO4-0.02g·mL-1H2SO4的混合液(1∶1，V/V)中，調(diào)pH值=1,定容至100 mL得備用液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取0.1000 g 硫酸軟骨素對(duì)照品，定容至100 mL，分別精確量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL的硫酸軟骨素溶液加入至具塞試管中，在各個(gè)試管中分別加入蒸餾水1.0、0.9、0.8、0.6、0.4、0.2 mL。在各個(gè)試管中添加提前溶解好的阿利新藍(lán)溶液15 ml，放置15 min后得備用液。

2.3 吸收波長(zhǎng)的確定

采用阿利新藍(lán)比色法，以硫酸軟骨素為對(duì)照品，在300～700nm處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取蜘蛛粉1.0000 g,按1∶2加入石油醚和無(wú)水乙醇進(jìn)行脫脂2h，脫脂、抽濾后按一定的料液比加入蒸餾水。然后在40 ℃，pH值=8，胰蛋白酶2000 U的條件下酶解3h，然后在一定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行超聲提取2次，進(jìn)行抽濾，收集濾液,放至4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱(chēng)取0.1000 g硫酸軟骨素對(duì)照品，定容至100 mL，分別精確量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL的硫酸軟骨素溶液加入至具塞試管中，在各個(gè)試管中分別加入蒸餾水1.0、0.9、0.8、0.6、0.4、0.2 mL。各個(gè)試管中添加提前溶解好的阿利新藍(lán)溶液15 mL，放置15 min。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以波長(zhǎng)(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

2.6.1 料液比對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

在確保提取溫度50 ℃、提取時(shí)間80 min 不變的情況下，改變料液比，在料液比 1∶20，1∶30,1∶40,1∶50,1∶60 g·mL-1下提取糖胺聚糖，考察料液比對(duì)糖胺聚糖提取量的作用。

2.6.2 提取時(shí)間對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

在確保液料比 1∶40 g·mL-1，提取溫度50 ℃ 不變的情況下，改變提取時(shí)間，在提取時(shí)間為60、70、80、90、100 min下提取糖胺聚糖，考察提取時(shí)間對(duì)糖胺聚糖提取量的作用。

2.6.3 提取溫度對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

在確保料液比 1∶40 g·mL-1，提取時(shí)間80min不變的情況下，改變提取溫度，在提取溫度為30、40、50、60 ℃ 下提取糖胺聚糖，考察提取溫度對(duì)糖胺聚糖提取量的作用。

2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比(A)，提取時(shí)間(B)，提取溫度(C)為三個(gè)考察因素。優(yōu)化蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取工藝，采用 L9(34)正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素

2.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的標(biāo)準(zhǔn)[20-21]。

3 結(jié)果與分析

3.1 硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長(zhǎng)

經(jīng)在可見(jiàn)光下掃描，確定硫酸軟骨素最大吸收波長(zhǎng)在490 nm處，如圖1所示。

圖1 硫酸軟骨素全波長(zhǎng)掃描圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性與范圍

硫酸軟骨素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.0137X-0.0004，R2=0.9993,見(jiàn)表2及圖2。

表2 硫酸軟骨素線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 單因素試驗(yàn)

3.3.1 液料比對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

糖胺聚糖提取量隨著料液比的增大先增加后降低，在料液比為1∶40 g·mL-1處出現(xiàn)最大值，可能由于料液比過(guò)小，則糖胺聚糖溶出量為飽和，不利于糖胺聚糖的充分溶出；而當(dāng)料液比過(guò)高，非糖胺聚糖類(lèi)物質(zhì)競(jìng)相溶出導(dǎo)致糖胺聚糖溶出量減少[22]。所以確定糖胺聚糖提取的最佳提取料液比為1∶40 g·mL-1。結(jié)果見(jiàn)圖 3。

圖3 料液比對(duì)糖胺聚糖提取量的作用

3.3.2 提取時(shí)間對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

糖胺聚糖提取量隨著提取時(shí)間增大先增大后逐漸趨于平緩，可能是因?yàn)樘前肪厶墙隽恳呀?jīng)達(dá)到飽和，不再溶出。從節(jié)約能源方面考慮，確定糖胺聚糖提取的最佳提取時(shí)間是80 min。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)糖胺聚糖提取量的作用

3.3.3 提取溫度對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

糖胺聚糖提取量隨著提取溫度增大先增加后降低，當(dāng)溫度為50 ℃ 時(shí)具有最高點(diǎn) ，這是因?yàn)殡S溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，利于糖胺聚糖破壁溶出，但溫度過(guò)高，部分蛋白變性失活凝固不利于糖胺聚糖溶出，所以確定糖胺聚糖提取的最佳提取溫度為50 ℃。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取溫度對(duì)糖胺聚糖提取量的作用

3.4 正交實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用的是正交試驗(yàn)法，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)表結(jié)果

表4 方差分析表

注：F0.05(2,2)=19，P<0.05為顯著， P<0.01為極顯著。

由表4得出：料液比(A)，提取時(shí)間(B)，提取溫度(C)對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取均具有明顯性的作用。料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)糖胺聚糖的提取量作用程度為：料液比(A)>提取時(shí)間(B)>提取溫度(C)。因此，得到在正交試驗(yàn)范圍內(nèi)的最佳提取條件是A2B3C1，即料液比為1∶40 g·mL-1，提取時(shí)間為80 min，提取溫度為50 ℃。

3.5 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

在正交試驗(yàn)范圍內(nèi)的最佳提取條件A2B3C1下，進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

由表5可知，按最佳提取條件：料液比1∶40 mg/mL,提取時(shí)間80 min,提取溫度50 ℃，從1.0000 g 的蜘蛛粉中提取糖胺聚糖，平均提取量為21.072 mg·g-1，提取量較高且具有重復(fù)性，驗(yàn)證了所選提取工藝參數(shù)的合理性。

4 討論

由方差分析得出：料液比對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取作用最顯著，其中當(dāng)料液比為1∶40時(shí)提取量達(dá)到最高。提取時(shí)間對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取作用的程度比料液比對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取作用的程度弱一點(diǎn)，當(dāng)提取時(shí)間為80 min時(shí)提取量較高。提取溫度對(duì)蜘蛛粉糖胺聚糖的提取效果也有較大的作用，但不如料液比及提取時(shí)間對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取的作用強(qiáng)。其中，當(dāng)提取溫度為50 ℃ 時(shí)，提取含量最高。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化蜘蛛粉中糖胺聚糖最佳提取工藝，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出料液比對(duì)糖胺聚糖的提取作用最顯著，是蜘蛛粉中糖胺聚糖提取的關(guān)鍵因素。通過(guò)最佳提取工藝，對(duì)蜘蛛粉中糖胺聚糖進(jìn)行提取，提取量為21.072 mg·g-1，試驗(yàn)方法重復(fù)性高，可用于其他藥物糖胺聚糖工藝提取。

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