基于掃描電鏡觀察研究真菌孢子檢測(cè)對(duì)稻谷霉變判定

唐 芳 歐陽(yáng)毅 祁智慧

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

稻谷是我國(guó)主要口糧，作為戰(zhàn)略儲(chǔ)備糧之一，部分稻谷儲(chǔ)存時(shí)間超過(guò)一年，因此稻谷儲(chǔ)藏安全是關(guān)系到百姓健康、關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的大事。近年來(lái)，部分稻米加工和儲(chǔ)藏企業(yè)為了提高經(jīng)濟(jì)效益，盡可能提高稻谷儲(chǔ)藏水分，以提高整精米率。而高水分稻谷儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中，很容易為微生物滋生提供條件。稻谷的儲(chǔ)藏安全問(wèn)題不容忽視。稻谷儲(chǔ)藏是否安全，首先要明確判定標(biāo)準(zhǔn)。針對(duì)糧食儲(chǔ)藏安全判定標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了大量研究工作，總體可歸納為三大類[1]：CO2和干重?fù)p失、籽粒發(fā)芽能力、肉眼可見(jiàn)霉菌。依據(jù)C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+heat公式，儲(chǔ)糧質(zhì)量變化與糧食自身以及生長(zhǎng)的微生物呼吸代謝密切相關(guān)。Karunakaran等[2-4]通過(guò)測(cè)CO2釋放速率預(yù)測(cè)糧食質(zhì)量下降情況，由于檢測(cè)需要精密儀器，且受實(shí)際倉(cāng)儲(chǔ)氣密性影響，CO2波動(dòng)范圍較大，鮮見(jiàn)在實(shí)際倉(cāng)儲(chǔ)中應(yīng)用。Seib[5]等提出將干重?fù)p失作為糧食質(zhì)量變化一項(xiàng)指標(biāo)，但干重?fù)p失多少時(shí)糧食質(zhì)量達(dá)到不可接受的程度，仍備受爭(zhēng)議[5-7]。發(fā)芽能力是種子具有生命力的典型特征，可作為糧食種子安全的判定標(biāo)準(zhǔn)[4,8-10]，它受溫度、水分、破碎以及蟲(chóng)霉侵染等多方面因素的影響，很容易導(dǎo)致下降，因此，作為口糧或儲(chǔ)備糧質(zhì)量安全的判定標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于嚴(yán)格。肉眼可見(jiàn)霉菌是應(yīng)用較為廣泛的判定標(biāo)準(zhǔn)，因其操作簡(jiǎn)單直觀，有些學(xué)者認(rèn)為是最佳的判定標(biāo)準(zhǔn)[11-13]，同時(shí)也有部分學(xué)者提出這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)仍存在缺點(diǎn)[14-15]：一方面，肉眼觀察到糧粒上有霉變時(shí)，糧食質(zhì)量已經(jīng)出現(xiàn)問(wèn)題，缺乏預(yù)測(cè)性，另一方面，觀察者主觀性很強(qiáng)，判別差異性很大。因此，肉眼可見(jiàn)霉菌作為安全的判定標(biāo)準(zhǔn)也一直備受爭(zhēng)議。Magan曾提出[15]，顯微鏡下觀察到微生物菌絲及孢子生長(zhǎng)更為及時(shí)準(zhǔn)確。筆者認(rèn)為，為確保糧食食用安全，不發(fā)生霉變是最基本判定依據(jù)。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)多年的研究，建立儲(chǔ)糧霉菌檢測(cè)方法——真菌孢子計(jì)數(shù)法[16]。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)倉(cāng)儲(chǔ)藏稻谷樣品為研究對(duì)象，基于掃描電鏡觀察稻谷籽粒不同加工階段微生物生長(zhǎng)情況，并與原糧真菌孢子計(jì)數(shù)檢出水平進(jìn)行對(duì)比，以確定稻谷霉變檢測(cè)判定界限，用于指導(dǎo)儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中稻谷霉變判定，為稻谷儲(chǔ)藏安全提供檢測(cè)和判定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

東北粳稻，采自北京某糧食收儲(chǔ)庫(kù)，2016年4月入庫(kù)，9月29日糧堆表層共選取12個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)在距離表面40 cm出手動(dòng)采樣，取樣量500 g左右，樣品于4 ℃低溫保存。

1.2 主要儀器

SMART生物顯微鏡：重慶奧特公司；M205FA體視顯微鏡：德國(guó)徠卡公司；E1010離子濺射儀：日本日立公司；S-3000N掃描電子顯微鏡：日本日立公司；JDMZ 100稻谷出米率檢測(cè)儀：北京東方孚德公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 真菌孢子計(jì)數(shù)法[16]

1.3.2 稻谷脫殼碾米處理

從備選樣品中稱取一定量稻谷籽粒，一部分采用手工脫殼，一部分采用礱谷脫殼，脫殼后糙米裝入密封袋內(nèi)標(biāo)注備用。取一定量礱谷脫殼糙米進(jìn)行碾米加工，制備一級(jí)大米[17]，并分裝入密封袋內(nèi)標(biāo)注備用。

1.3.3 體視顯微鏡觀察

稱取一定量實(shí)驗(yàn)稻谷原糧籽粒及糙米樣品，用體視顯微鏡放大8倍左右進(jìn)行觀察。

1.3.4 掃描電鏡觀察

對(duì)稻谷原糧籽粒、處理后糙米以及一級(jí)大米，按照組別隨機(jī)選取三粒，將試驗(yàn)樣品有序粘在掃描電鏡樣品盤上，采用離子濺射儀對(duì)樣品表層進(jìn)行噴金處理，并對(duì)籽粒胚乳和胚部進(jìn)行掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

大部分真菌具有好氧生長(zhǎng)特性，糧食儲(chǔ)存期間，適宜條件下，真菌先在糧粒表面開(kāi)始生長(zhǎng)。針對(duì)這一特性，筆者開(kāi)發(fā)了儲(chǔ)糧真菌快速檢測(cè)方法—真菌孢子計(jì)數(shù)法：一定量的糧食樣品，通過(guò)加水劇烈振蕩，洗脫糧粒表面已生長(zhǎng)的真菌孢子，洗脫液過(guò)濾后，于顯微鏡下放大600～800倍進(jìn)行真菌孢子觀察計(jì)數(shù)。采用該方法對(duì)不同感染水平的小麥、稻谷樣品進(jìn)行了重復(fù)性實(shí)驗(yàn)(n=8)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)范圍在8.2%～31.4%；與平板菌落計(jì)數(shù)法比較，相關(guān)系數(shù)r2=0.847 9，表明兩種方法具有良好的相關(guān)性[16]。方法操作簡(jiǎn)單，單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間2-3 min。方法特點(diǎn)是在傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)真菌孢子檢測(cè)濃度設(shè)限(1.0×105個(gè)/g)，消除了樣品自身攜帶真菌孢子的干擾，達(dá)到僅檢測(cè)儲(chǔ)藏過(guò)程中生長(zhǎng)真菌的目的。

本研究采用上述真菌孢子檢測(cè)方法，對(duì)糧庫(kù)采集的樣品進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，選取孢子檢出水平范圍分別在0～5.0×104、1.0～5.0×105、1.0～5.0×106個(gè)/g的樣品，標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 組。對(duì)各組樣品進(jìn)行表觀色澤氣味觀察比較，并對(duì)各組樣品原糧、糙米、一級(jí)大米進(jìn)行顯微特征觀察。具體研究結(jié)果如下。

2.1 表觀色澤氣味比較

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組樣品并排擺放，肉眼觀察，顏色略有差別，但不明顯。每個(gè)樣品肉眼觀察時(shí)，未見(jiàn)明顯霉變籽粒。不同組別的稻谷樣品，剛開(kāi)啟密封袋時(shí)，氣味略顯差異，Ⅰ組樣品略帶稻谷固有香氣，Ⅱ組樣品無(wú)香氣也無(wú)異味，Ⅲ組樣品略帶霉味。密封袋開(kāi)封后敞開(kāi)放置一段時(shí)間，氣味沒(méi)有差異。

2.2 體視顯微鏡觀察結(jié)果

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組樣品，每組樣品中隨機(jī)稱取20 g原糧籽粒放于玻璃皿中待觀察。每組樣品各稱取100 g樣品進(jìn)行礱谷脫殼，然后稱取20 g糙米籽粒放于玻璃皿中待觀察。按方法1.3.3分別觀察原糧籽粒和糙米籽粒，觀察結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻谷表面體視顯微鏡圖片(8×)

圖2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組糙米表面體視顯微鏡圖片(8×)

從圖1、圖2可以看出，Ⅰ組稻谷穎殼顏色鮮亮，Ⅱ組少數(shù)籽粒穎殼有銹斑，顏色略暗，Ⅲ組部分籽粒穎殼有銹斑，顏色變暗。銹斑在8倍放大的情況下，不能確認(rèn)為霉菌斑。對(duì)各組別糙米放大觀察，糙米色澤亮度未見(jiàn)明顯差異，三組糙米表面均未見(jiàn)明顯霉斑，未達(dá)到稻谷國(guó)標(biāo)[18]中“生霉粒”的標(biāo)準(zhǔn)——“稻谷粒生霉，去殼后糙米表面有霉斑的顆粒”。但仔細(xì)觀察，Ⅲ組糠皮層局部破壞區(qū)增加，胚芽部分不夠飽滿。

2.3 掃描電鏡觀察結(jié)果

2.3.1 稻殼表面

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻谷樣品中，隨機(jī)選擇稻谷籽粒，掃描電鏡放大500倍后，觀察稻殼表面情況。從圖3可以看出，不同組別稻殼表面菌絲和孢子分布密度存在明顯差異。Ⅰ組稻谷穎殼凸起光滑，表面難尋真菌孢子和菌絲蹤跡；Ⅱ組穎殼表面可見(jiàn)附著物，可觀察到真菌孢子與菌絲結(jié)構(gòu)；Ⅲ組穎殼表面附著物數(shù)量明顯增加，真菌孢子和菌絲明顯比Ⅱ組多。

圖3 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻殼表面電鏡掃描圖片(500×)

2.3.2 糙米表面

2.3.2.1 手剝脫殼糙米表面電鏡觀察

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻谷樣品，隨機(jī)稱取10 g樣品，逐一采用手剝脫殼，并置于玻璃皿中。每組糙米樣品隨機(jī)選取3粒，按1.3.4方法處理，并對(duì)籽粒胚乳和胚部進(jìn)行掃描電鏡觀察。每組3粒樣品電鏡觀察后，選取共性較強(qiáng)具有代表性的圖片進(jìn)行比較，觀察結(jié)果見(jiàn)圖4～圖7。

由圖4～圖7可以看出，Ⅰ組稻谷真菌孢子檢出水平為0～5.0×104個(gè)/g，糙米籽粒胚乳及胚部表面幾乎找不到真菌孢子與菌絲；Ⅱ組檢出水平為1.0～5.0×105個(gè)/g，可觀察到少量真菌孢子與菌絲；Ⅲ組檢出水平為1.0～5.0×106個(gè)/g，可觀察到大量真菌孢子與菌絲體，密度大，菌絲較Ⅱ組的粗壯，且分布較多分生孢子梗結(jié)構(gòu)。手剝脫殼情況下，對(duì)糙米糠皮層幾乎沒(méi)有損傷，外層果皮上生長(zhǎng)的菌絲和孢子幾乎保留原有狀態(tài)。不同組別樣品糙米表面真菌孢子和菌絲分布密度與稻谷原糧真菌孢子檢出水平呈正相關(guān)。

圖4 Ⅰ組手剝脫殼糙米胚部表面(左100×、右500×)

圖5 Ⅱ組手剝脫殼糙米胚部表面(左100×、右500×)

圖6 Ⅲ組手剝脫殼糙米胚部表面(左100×、右500×)

圖7 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組手剝脫殼糙米胚乳表面(1 000×)

稻米雖有穎殼保護(hù)，當(dāng)微生物生長(zhǎng)到一定程度時(shí)，可通過(guò)縫隙或裂縫進(jìn)入，進(jìn)一步侵染糙米表面。微生物生長(zhǎng)會(huì)分泌酶類,為其生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)而導(dǎo)致裂縫擴(kuò)大[19]。Ⅲ組糙米胚及胚乳表面存在大量的菌絲孢子，多個(gè)分生孢子梗結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，且胚部菌絲孢子量明顯大于胚乳，這與胚芽營(yíng)養(yǎng)豐富有關(guān)。而這些糙米樣品，肉眼觀察時(shí)無(wú)明顯差別。

2.3.2.2 礱谷機(jī)械脫殼糙米表面電鏡觀察

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻谷樣品，隨機(jī)稱取30 g樣品，礱谷脫殼后得到糙米，并分別置于玻璃皿中。后續(xù)處理方法同手剝脫殼糙米樣品，觀察結(jié)果見(jiàn)圖8～圖11。

圖8 Ⅰ組礱谷脫殼糙米胚乳表面(左40×，右1 000×)

圖9 Ⅱ組礱谷脫殼糙米胚乳表面(左40×、右1 000×)

圖10 Ⅲ組礱谷脫殼糙米胚乳表面(左40×、右1 000×)

圖11 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組礱谷脫殼糙米胚部 (1 000×)

由組圖8～圖11可以看出，礱谷脫殼過(guò)程中，由于膠輥的擠壓和撕搓，致使穎殼脫離，對(duì)大面積鼓起的胚乳部分有一定的損傷。I組表面干凈，Ⅱ組表面可觀察到菌絲附著，有個(gè)別散落的孢子，Ⅲ組仍可觀察到大量散落的孢子以及被撕扯過(guò)菌絲。處于端側(cè)的胚部是內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，損傷較小，與手動(dòng)剝殼比較，Ⅱ、Ⅲ組糙米胚部仍可清晰觀察到菌絲孢子結(jié)構(gòu)，但由于機(jī)械摩擦振動(dòng)或風(fēng)力作用，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及部分孢子會(huì)脫落，孢子數(shù)量相應(yīng)減少。由此可見(jiàn)，由于礱谷脫殼對(duì)糙米表面會(huì)造成一定程度的機(jī)械損傷，破壞糠皮層的完整結(jié)構(gòu)。若稻谷原糧已有一定程度真菌生長(zhǎng)，糙米表面損傷將為真菌入侵籽粒內(nèi)部提供有利條件，造成潛在的安全隱患。

2.3.3 一級(jí)大米表面電鏡觀察

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組稻谷樣品，隨機(jī)稱取100 g樣品，按大米國(guó)標(biāo)[17]要求礱碾至一級(jí)大米，并置于玻璃皿中。后續(xù)處理方法同手剝脫殼糙米樣品，觀察結(jié)果見(jiàn)圖12、圖13。

圖12 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組一級(jí)大米胚乳部位表面

圖13 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組一級(jí)大米胚部表面(1 000×)

圖12為一級(jí)大米胚乳表面，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組一級(jí)大米粒表面幾乎沒(méi)有皮層殘留痕跡，亞糊粉層直接暴露。粒面基本觀察不到完整的孢子菌絲結(jié)構(gòu)。亞糊粉層隨著真菌檢出水平的增加，表面呈現(xiàn)逐漸平滑趨勢(shì)。圖13為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組樣品米胚去凈后，胚部淀粉質(zhì)細(xì)胞直接暴露，細(xì)胞壁清晰可見(jiàn)。細(xì)胞內(nèi)淀粉顆粒粒徑存在明顯差異，隨原糧真菌孢子檢出水平升高，粒徑逐步變小。胚芽營(yíng)養(yǎng)豐富，為微生物生長(zhǎng)提供了充足的養(yǎng)分，而胚部真菌大量生長(zhǎng)繁殖，已經(jīng)穿透胚芽，影響到胚部細(xì)胞層。因此，導(dǎo)致真菌分布密度越大，胚部細(xì)胞淀粉顆粒粒徑越小，兩者呈負(fù)相關(guān)。

由此可見(jiàn)，糙米經(jīng)過(guò)碾磨處理后，大部分表層的菌絲孢子可被清除，但大米亞糊粉層及胚部細(xì)胞發(fā)生的變化，仍與微生物生長(zhǎng)程度密切相關(guān)。化學(xué)成分是否有變化或微生物代謝產(chǎn)物是否有積累，仍需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

3.1 稻谷雖有穎殼保護(hù)，霉菌菌絲仍能通過(guò)縫隙或裂縫進(jìn)入，在糙米表面生長(zhǎng)繁殖，且胚芽部位因營(yíng)養(yǎng)豐富，霉菌生長(zhǎng)量大于胚乳部分。

3.2 糙米表面攜帶的真菌孢子菌絲量與原糧表面真菌孢子檢出水平呈正相關(guān)。通過(guò)掃描電鏡觀察研究，初步確定真菌孢子檢出在1.0～5.0×105個(gè)/g水平時(shí)，稻谷籽粒可判定為開(kāi)始霉變，1.0～5.0×106個(gè)/g水平時(shí)，稻谷籽粒可判定為嚴(yán)重霉變。

3.3 原糧真菌孢子檢出水平在1.0～106個(gè)/g以上，機(jī)械脫殼的糙米，糠皮層遭到破壞，表面損傷為真菌入侵籽粒內(nèi)部提供有利條件，糙米儲(chǔ)存存在較大安全隱患。經(jīng)碾磨后得到一級(jí)大米，胚乳亞糊粉層以及胚部淀粉顆粒均發(fā)生一定程度的變化，是否存在食用安全隱患，有待于進(jìn)一步研究。

[1]KALETA A, GORNICKI K. Criteria of Determination of Safe Grain Storage Time. Review. 2013. http://dx.doi.org/10.5772/52235. http://cdn.intechopen.com/pdfswm/39944.pdf

[2] WHITE N D G, SINHA R N, MUIR W E. Intergranular carbon dioxide as an indicator of biological activity associated with the spoilage of stored wheat[J]. Canadian Agricultural Engineering, 1982, 24:35-42

[3] SROUR S. Thermic properties of grains-production of heat and CO2[M]//Multon J L. Preservation and Storage of Grain, Seeds and their By-Products -Cereals, Oilseeds, Pulses and Animal Feed. New York: Lavoisier Publishing, ISBN 2-85 206-4367, 1988:189-202

[4]KARUNAKARAN C, MUIR W E, JAYAS D S, et al. Safe storage time of high moisture wheat[J]. Journal of Stored Products Research, 2001, 37(3):303-312

[5]SEIB P A, PFOST H B, SUKABDI A, et al. Spoilage of rough rice measured by evolution of carbon dioxide, Proceedings of the 3rd annual workshop on Grains Post-harvest Technology, 1980:75-93, Kuala Lumpur, Malaysia, 29-31

[6]FREER M W, SIEBENMORGEN T J, COUVILLION R J, et al. Modeling temperature and moisture content changes in bunker-stored rice[J]. Transactions of the ASAE, 1990, 33(1):211-220

[7]ADHIKARINAYAKE T B, PALIPANE K B, MüLLER J. Quality change and mass loss of paddy during airtight storage in a ferro-cement bin in Sri Lanka[J]. Journal of Stored Products Research, 2006, 42(3):377-390

[8]BLACK M. Seed germination and dormancy[J]. Science Progress, 1970, 58:379-393

[9]POMERANZ Y. Biochemical, functional and nutritive changes during storage [M]//Christiansen C M. Storage of cereal grains and their products. 3rd edition. USA: American Association of Cereal Chemists, ISBN 0913250236, 1982:56-114

[10]AL-YAHYA S A. Effect of storage conditions on germination in wheat[J]. Journal of Agronomy & Crop Science, 2001, 186(4):273-279

[11]BOWDEN P J, LAMOND W J, SMITH E A. Simulation of near-ambient grain drying. 1. Comparison of simulations with experimental results[J]. Journal of Agricultural Engineering Research, 1983, 28(4):279-300

[12]RYNIECKI A, NELLIST M E. Optimization of control systems for near-ambient grain drying[J]. Journal of Agricultural Engineering Research, 1991, 48:1-35

[13]NELLIST M E. Bulk storage drying in theory and practice[J]. Journal of the Royal Agricultural Society of England, 1998, 159:120-135

[14]FLEURAT-LESSARD F. Qualitative reasoning and integrated management of the quality of stored grain: a promising new approach[J]. Journal of Stored Products Research, 2002,38(3): 191-218

[15]MAGAN N.Early detection of fungi in stored grain[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 1993, 32(1-3):145-160

[16]程樹(shù)峰, 唐芳, 伍松陵. 儲(chǔ)糧真菌危害早期檢測(cè)方法的研究 [J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2011, 26(4): 85-88

CHENG Shufeng, TANG Fang, WU Songling. Study of determination of early deterioration of stored grain by fungi[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2011, 26(4): 85-88

[17] GB 1354—2009大米

GB 1354—2009 Rice

[18]GB 1350—2009稻谷

GB 1350—2009 Paddy

[19]MANGALA H A, REDDY K R N, SINGOTAMU L, et al.Aspergillicolonize and produce AFB1 in discolored rice grain[J]. Journal of Mycology and Plant Pathology, 2006, 36(3):418-426.