利用酶法測(cè)定稻米支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)

周慧穎 歐陽林娟 彭小松 朱昌蘭 陳小榮 傅軍如 邊建民 胡麗芳 賀浩華 賀曉鵬

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；雙季稻現(xiàn)代化生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南昌 330045)

支鏈淀粉作為稻米胚乳最主要的組分，是稻米品質(zhì)和淀粉理化特性的主要決定因素[1-3]。支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)包括平均鏈長(zhǎng)(CL)、平均外部鏈長(zhǎng)(ECL)、平均內(nèi)部鏈長(zhǎng)(ICL)、A∶B值(每條B鏈上所具有的A鏈數(shù)目)、鏈長(zhǎng)和鏈長(zhǎng)分布等參數(shù)[4]。目前對(duì)稻米支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究主要是利用凝膠層析法、熒光糖電泳法(基于毛細(xì)管電泳、基于測(cè)序儀)等測(cè)定支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)和鏈長(zhǎng)分布[5-7]。利用酶法測(cè)定支鏈淀粉結(jié)構(gòu)是采用β-淀粉酶、異淀粉酶、普魯蘭酶這3種酶對(duì)支鏈淀粉進(jìn)行酶解，從而獲得β-淀粉酶水解率、CL、ECL、ICL、A∶B值等支鏈淀粉結(jié)構(gòu)參數(shù)，這些參數(shù)可更好地反映支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)。已有研究利用酶法對(duì)葛根[8]、銀杏[9]及慈姑[10]的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)定，而在水稻中利用酶法測(cè)定支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)鮮見報(bào)道。此外，前人在利用酶法測(cè)定葛根、銀杏及慈姑的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的具體過程中，酶解反應(yīng)條件存在一定差異，如在測(cè)定β-淀粉酶水解率時(shí)采用的β-淀粉酶用量分別是500、500、325 U，測(cè)定A∶B值時(shí)采用的異淀粉酶用量分別是2、80、80 U，且對(duì)酶解的最佳反應(yīng)時(shí)間沒有明確。本試驗(yàn)對(duì)酶法測(cè)定稻米支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的酶解反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，以期對(duì)稻米支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的測(cè)定和特性的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

秈稻品種為昌恢121、南京11、桂朝2號(hào)、昌恢T025；粳稻為寧粳1號(hào)、常粳06-3、武育粳7號(hào)、日本晴。昌恢121、昌恢T025為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)育成的恢復(fù)系材料，其他品種均引自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)。同期成熟種子收獲后曬干，存放3個(gè)月以上，用精米機(jī)充分研磨成精米后進(jìn)一步磨成米粉，采用賀曉鵬等[11]的方法進(jìn)行支鏈淀粉的分離和純化，得到純支鏈淀粉粉末后密封保存。

β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)、異淀粉酶(EC 3.2.1.68)：Sigma-Aldrich公司。

SCINO-CT410旋風(fēng)式樣品磨：瑞典FOSS公司；TU-1810D紫外可見分光光度計(jì)：北京普析公司。

1.2 β-淀粉酶酶解反應(yīng)條件的優(yōu)化及稻米支鏈淀粉β-淀粉酶水解率的測(cè)定

每個(gè)供試品種取5 mL離心管4個(gè)，加入純化的支鏈淀粉0.1 g分散于5 mL濃度為0.02 mol/L，pH 5.0的醋酸緩沖溶液中，分別加入300、400、500、600 U的β-淀粉酶，同時(shí)加入1～2滴甲苯防止微生物生長(zhǎng)，37 ℃水浴保溫約48 h后，將反應(yīng)液沸水浴滅酶25 min，冷卻后測(cè)定體系中的還原力(麥芽糖當(dāng)量)，以還原力不再增加的最低酶用量為優(yōu)化酶用量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

每個(gè)供試品種取5 mL離心管1個(gè)，加入純化的支鏈淀粉0.1 g分散于5 mL濃度為0.02 mol/L，pH 5.0的醋酸緩沖溶液中，加入優(yōu)化酶用量的β-淀粉酶，同時(shí)加入1～2滴甲苯防止微生物生長(zhǎng)，37 ℃水浴保溫，測(cè)定4 h至60 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)酶解反應(yīng)所產(chǎn)生的還原力，以還原力不再增加的最短時(shí)間為優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

在酶用量和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的基礎(chǔ)上，測(cè)定反應(yīng)體系中的總糖和還原力，重復(fù)3次，以不加酶的樣品同樣處理作為對(duì)照，計(jì)算稻米支鏈淀粉β-淀粉酶水解率：

β-淀粉酶水解率=還原力(麥芽糖當(dāng)量)×100/總糖 (麥芽糖當(dāng)量)

1.3普魯蘭酶反應(yīng)條件的優(yōu)化及稻米支鏈淀粉CL、ECL、ICL的測(cè)定

每個(gè)供試品種取5 mL離心管4個(gè)，稱取22 mg純支鏈淀粉，加入濃度為0.05 mol/L, pH 5.0的醋酸緩沖液5 mL，充分混勻后加入2、4、6、8 U的普魯蘭酶，液面以1～2滴甲苯防止微生物生長(zhǎng)，37 ℃水浴保溫約24 h后，將反應(yīng)液沸水浴滅酶20 min，冷卻后測(cè)定體系中的還原力，以還原力不再增加的最低酶用量為優(yōu)化酶用量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

每個(gè)供試品種取5 mL離心管1個(gè)，稱取22 mg純支鏈淀粉，加入濃度為0.05 mol/L, pH 5.0的醋酸緩沖液5 mL，充分混勻后加入優(yōu)化酶用量的普魯蘭酶，同時(shí)加入1～2滴甲苯防止微生物生長(zhǎng)，37 ℃水浴保溫，測(cè)定4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間段內(nèi)酶解反應(yīng)所產(chǎn)生的還原力，以還原力不再增加的最短時(shí)間為優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

在酶用量和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的基礎(chǔ)上，測(cè)定反應(yīng)體系中的總糖和總還原力，重復(fù)3次，以不加酶的樣品同樣處理作為對(duì)照計(jì)算CL，同時(shí)根據(jù)所測(cè)定的β-淀粉酶水解率可以計(jì)算出支鏈淀粉的ECL和ICL。

CL=產(chǎn)物中的總糖(葡萄糖當(dāng)量)/產(chǎn)物中的總還原力(葡萄糖當(dāng)量)

ECL=CL ×β-淀粉酶水解率+2.0

ICL=(CL-ECL)-1.0

1.4 β-淀粉酶和普魯蘭酶酶解溫度的確定

根據(jù)所購β-淀粉酶和普魯蘭酶的質(zhì)檢報(bào)告，β-淀粉酶和普魯蘭酶的推薦反應(yīng)溫度分別為20 ℃和25 ℃，杜先鋒等[8]、敖自華等[9]采用β-淀粉酶、普魯蘭酶進(jìn)行水解反應(yīng)時(shí)，采用的反應(yīng)溫度均為37 ℃。為此，在β-淀粉酶和普魯蘭酶酶用量和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的基礎(chǔ)上，設(shè)置20、37 ℃和25、37 ℃兩種溫度，測(cè)定不同品種在兩種反應(yīng)溫度下酶解產(chǎn)生的還原力，明確β-淀粉酶和普魯蘭酶酶解反應(yīng)的最佳溫度。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.5 支鏈淀粉A∶B值酶解反應(yīng)條件的優(yōu)化及測(cè)定

將測(cè)定β-淀粉水解率時(shí)的最終反應(yīng)液加入3倍體積無水甲醇，冰浴30 min后6 000 r/min離心5 min，傾去上清液，加入75%的甲醇沖洗沉淀，37 ℃恒溫干燥后用研缽磨成細(xì)粉，獲得支鏈淀粉β-極限糊精。稱取5 mg β-極限糊精粉末于2 mL離心管中，加入200 μL蒸餾水，沸水浴中加熱攪拌10 min后，加入濃度為0.04 mol/L，pH 4.5的醋酸緩沖液，再次置沸水浴中加熱攪拌10 min，冷卻至室溫，制成1 mg/mL的β-極限糊精溶液。

每個(gè)供試品種取2 mL離心管5個(gè)，量取β-極限糊精溶液1 mL，首先分別加入2、10、50、100、150 U的異淀粉酶進(jìn)行第一步脫支水解，37 ℃水浴保溫，24 h后將反應(yīng)液置沸水浴中25 min滅酶，冷卻后測(cè)定反應(yīng)液中的還原力，以還原力不再增加的最低酶用量為異淀粉酶優(yōu)化酶用量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

每個(gè)供試品種取2 mL離心管1個(gè)，量取β-極限糊精溶液2 mL，加入優(yōu)化酶用量的異淀粉酶，同時(shí)加入1～2滴甲苯防止微生物生長(zhǎng)，37 ℃水浴保溫，測(cè)定4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間段內(nèi)酶解反應(yīng)所產(chǎn)生的還原力，以還原力不再增加的最短時(shí)間為優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間，此時(shí)反應(yīng)液中的還原力為C1。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

在異淀粉酶用量和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的基礎(chǔ)上，每個(gè)供試品種取2 mL離心管4個(gè)，取異淀粉酶水解后的反應(yīng)液 1 mL，再次分別加入0.6、0.8、1、1.2 U的普魯蘭酶第二步脫支水解，37 ℃水浴保溫，24 h后將反應(yīng)液置沸水浴中25 min滅酶，冷卻后測(cè)定反應(yīng)液中的還原力，以還原力不再增加的最低酶用量為普魯蘭酶優(yōu)化酶用量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

在異淀粉酶用量和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的基礎(chǔ)上，每個(gè)供試品種取2 mL離心管1個(gè)，取異淀粉酶水解后的反應(yīng)液1 mL，向每個(gè)供試品種的體系中加入優(yōu)化酶用量的普魯蘭酶，測(cè)定4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)酶解反應(yīng)所產(chǎn)生的還原力，以還原力不再增加的最短時(shí)間為優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間，此時(shí)反應(yīng)液中的還原力為C2，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

根據(jù)測(cè)定的C1、C2可計(jì)算出稻米支鏈淀粉的A∶B值：

C1=B+0.5A

C2=B+A

2 結(jié)果與分析

2.1稻米支鏈淀粉β-淀粉酶水解率測(cè)定的最適反應(yīng)條件

2.1.1 β-淀粉酶水解率測(cè)定的最適酶用量

圖1為8種稻米支鏈淀粉分別加入300、400、500、600 U β-淀粉酶的反應(yīng)體系37 ℃酶解48 h后的還原力(麥芽糖當(dāng)量)測(cè)定結(jié)果。從圖1中可以看出，隨著酶用量的增加，反應(yīng)體系中的還原力相應(yīng)增大，當(dāng)酶用量為500 U時(shí)開始，體系中的還原力基本保持恒定，隨后酶用量的增加體系中的還原力不再增大。可見，對(duì)于0.1 g的稻米支鏈淀粉，測(cè)定β-淀粉酶水解率時(shí)β-淀粉酶的最適酶用量為500 U，與測(cè)定葛根、銀杏支鏈淀粉β-淀粉酶水解率的酶用量(500 U)相同[8-9]，大于測(cè)定慈姑支鏈淀粉β-淀粉酶水解率的酶用量(325 U)[10]。

注：數(shù)據(jù)為平均值，短線表示均方差，不同小寫字母代表處理間達(dá)顯著差異水平(P<0.05)，余同。圖1 稻米支鏈淀粉β-淀粉酶水解率測(cè)定時(shí)β-淀粉酶用量與還原力生成的關(guān)系

2.1.2 β-淀粉酶水解率測(cè)定的最適反應(yīng)時(shí)間

圖2為8種稻米支鏈淀粉加入β-淀粉酶500 U，37 ℃水浴酶解后，4 h至60 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)酶解反應(yīng)體系中還原力(麥芽糖當(dāng)量)的測(cè)定結(jié)果。從圖2中可以看出，隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加，不同品種支鏈淀粉的水解程度均相應(yīng)增大，水解初期，還原力增加較快，而后逐漸緩慢，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到48 h后開始，反應(yīng)體系中所產(chǎn)生的還原力基本上達(dá)到一個(gè)平穩(wěn)值，水解程度達(dá)到最大，隨后還原力不再而增加。可見，對(duì)于0.1 g的稻米支鏈淀粉，測(cè)定β-淀粉酶水解率時(shí)的最適酶解時(shí)間為48 h。

圖2 稻米支鏈淀粉β-淀粉酶水解率測(cè)定時(shí)酶解反應(yīng)時(shí)間與還原力生成的關(guān)系

2.1.3 β-淀粉酶水解率測(cè)定的最適反應(yīng)溫度

圖3為8種稻米支鏈淀粉分別在20、37 ℃兩種水浴溫度下(酶用量500 U，反應(yīng)時(shí)間48 h)的還原力的測(cè)定結(jié)果。從圖3中可以看出，反應(yīng)體系溫度為37 ℃時(shí)，8個(gè)品種的還原力均大于20 ℃時(shí)的還原力。可見，對(duì)于0.1 g的稻米支鏈淀粉，測(cè)定β-淀粉酶水解率時(shí)的最適反應(yīng)溫度為37 ℃。

圖3 稻米支鏈淀粉β-淀粉酶水解率測(cè)定時(shí)不同反應(yīng)溫度下的還原力

2.2 稻米支鏈淀粉鏈長(zhǎng)測(cè)定的最適反應(yīng)條件

2.2.1 CL測(cè)定的最適酶用量

圖4為8種稻米支鏈淀粉分別加入2、4、6、8 U普魯蘭酶的反應(yīng)體系37 ℃酶解24 h后的還原力(葡萄糖當(dāng)量)的測(cè)定結(jié)果。從圖4中可以看出，隨著酶用量的增加，反應(yīng)體系中的還原力相應(yīng)增大，當(dāng)酶用量為4 U時(shí)開始，體系中的還原力基本保持恒定，隨后酶用量的增加體系中的還原力不再增大。可見，對(duì)于22 mg的稻米支鏈淀粉，測(cè)定CL時(shí)的普魯蘭酶最適酶用量為4 U，與測(cè)定銀杏支鏈淀粉CL的酶用量(4 U)相同[9]，大于測(cè)定慈姑支鏈淀粉CL的酶用量(3 U)[10]。

圖4 稻米支鏈淀粉CL測(cè)定時(shí)普魯蘭酶用量與還原力生成的關(guān)系

2.2.2 CL測(cè)定的最適反應(yīng)時(shí)間

圖5為8種稻米支鏈淀粉加入普魯蘭酶4 U，37 ℃水浴酶解后， 4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)酶解反應(yīng)體系中還原力(葡萄糖當(dāng)量)的測(cè)定結(jié)果。從圖5中可以看出，隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加，不同品種支鏈淀粉的水解程度均相應(yīng)增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到24 h后開始，反應(yīng)體系中所產(chǎn)生的還原力基本上達(dá)到一個(gè)平穩(wěn)值，水解程度達(dá)到最大，隨后還原力不再增加。可見，對(duì)于22 mg的稻米支鏈淀粉，測(cè)定CL時(shí)的最適酶解時(shí)間為24 h。

圖5 稻米支鏈淀粉CL測(cè)定時(shí)酶解反應(yīng)時(shí)間與還原力生成的關(guān)系

2.2.3 CL測(cè)定的最適反應(yīng)溫度

圖6為8種稻米支鏈淀粉在25、37 ℃兩種水浴溫度下(酶用量4 U，反應(yīng)時(shí)間24 h)的還原力測(cè)定結(jié)果。從圖6中可以看出，反應(yīng)體系溫度為37 ℃時(shí)，8個(gè)品種的還原力均大于25 ℃時(shí)的還原力。可見，對(duì)于22 mg的稻米支鏈淀粉，測(cè)定CL時(shí)的最適反應(yīng)溫度為37 ℃。

圖6 稻米支鏈淀粉CL測(cè)定時(shí)不同反應(yīng)溫度下的還原力

2.3 A∶B值最適反應(yīng)條件的優(yōu)化及測(cè)定

2.3.1 A∶B值測(cè)定時(shí)異淀粉酶的的最適酶用量

圖7為8種稻米β-極限糊精溶液分別加入2、10、50、100、150 U異淀粉酶的反應(yīng)體系37 ℃酶解24 h后的還原力(葡萄糖當(dāng)量)測(cè)定結(jié)果。從圖7中可以看出，隨著酶用量的增加，反應(yīng)體系中的還原力相應(yīng)增大，當(dāng)酶用量為100 U時(shí)，體系中的還原力基本保持恒定，隨后酶用量的增加體系中的還原力不再增大。可見，對(duì)于1 mL濃度為1 mg/mL的稻米β-極限糊精溶液，測(cè)定A∶B值時(shí)異淀粉酶的最適酶用量為100 U，高于測(cè)定銀杏、慈姑支鏈淀粉的酶用量(80 U)和葛根支鏈淀粉的酶用量(2 U)[8-10]。

圖7 稻米支鏈淀粉A∶B測(cè)定時(shí)異淀粉酶用量與還原力生成的關(guān)系

2.3.2 A∶B值測(cè)定時(shí)異淀粉酶的最適反應(yīng)時(shí)間

圖8為8種稻米β-極限糊精溶液加入異淀粉酶100 U，37 ℃水浴酶解后，4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)酶解體系中還原力(葡萄糖當(dāng)量)的測(cè)定結(jié)果。從圖8中可以看出，隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加，不同品種支鏈淀粉的水解程度均相應(yīng)增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到24 h后開始，反應(yīng)體系中所產(chǎn)生的還原力基本上達(dá)到一個(gè)平穩(wěn)值，水解程度達(dá)到最大，隨后還原力不再增加。可見，對(duì)于1 mL濃度為1 mg/mL的β-極限糊精溶液，測(cè)定A∶B值時(shí)的最適酶解時(shí)間為24 h。

圖8 稻米支鏈淀粉A∶B值測(cè)定時(shí)異淀粉酶酶解反應(yīng)時(shí)間與還原力生成的關(guān)系

2.3.3 A∶B值測(cè)定時(shí)普魯蘭酶的最適酶用量

圖9為8種稻米異淀粉酶水解反應(yīng)液再次分別加入0.6、0.8、1、1.2 U普魯蘭酶進(jìn)行第二步脫支水解，反應(yīng)體系37 ℃酶解24 h后的還原力(葡萄糖當(dāng)量)測(cè)定結(jié)果。從圖9中可以看出，隨著酶用量的增加，反應(yīng)體系中的還原力相應(yīng)增大，當(dāng)酶用量為1 U時(shí)，體系中的還原力基本保持恒定，隨后酶用量的增加體系中的還原力不再增大。可見，對(duì)于1 mL異淀粉酶水解后的反應(yīng)液，測(cè)定A∶B時(shí)普魯蘭酶的最適酶用量為1 U，與測(cè)定銀杏支鏈淀粉的酶用量(1 U)相同[9]，高于測(cè)定葛根支鏈淀粉的酶用量(0.6 U)[8]。

圖9 稻米支鏈淀粉A∶B測(cè)定時(shí)普魯蘭酶用量與還原力生成的關(guān)系

2.3.4 A∶B值測(cè)定時(shí)普魯蘭酶的最適反應(yīng)時(shí)間

圖10為種稻米異淀粉酶水解反應(yīng)液再次加入普魯蘭酶1 U，37 ℃水浴酶解后，4 h至32 h不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)酶解體系中還原力(葡萄糖當(dāng)量)的測(cè)定結(jié)果。從圖10中可以看出，隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加，不同品種支鏈淀粉的水解程度均相應(yīng)增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到24 h后開始，反應(yīng)體系中所產(chǎn)生的還原力基本上達(dá)到一個(gè)平穩(wěn)值，水解程度達(dá)到最大，隨后還原力不再增加。可見，對(duì)于1 mL異淀粉酶水解后的反應(yīng)液，測(cè)定A∶B時(shí)的最適酶解時(shí)間為24 h。

圖10 稻米支鏈淀粉A∶B值測(cè)定時(shí)普魯蘭酶酶解反應(yīng)時(shí)間與還原力生成的關(guān)系

2.4 8個(gè)水稻品種的支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)

表1為根據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)條件利用酶法測(cè)定的8個(gè)水稻品種的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)參數(shù)，由表1可見，8個(gè)水稻品種的β-淀粉酶水解率變幅為51.22%～62.86%，其中昌恢121最大，寧粳1號(hào)最小；CL的變幅為18.31～20.83，ECL的變幅為11.38～14.82，兩者中均為南京11最大，寧粳1號(hào)最小；ICL的變幅為4.57～5.93，寧粳1號(hào)最大，昌恢121最小；A∶B值的變幅為1.05～1.67，常粳06-3最大，昌恢T025最小。

表1 參試水稻品種的支鏈淀粉結(jié)構(gòu)

3 討論

利用酶法測(cè)定支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的基本原理首先是利用β-淀粉酶作用于支鏈淀粉的α-1,4-糖苷鍵形成了β-限制糊精，并獲得β-淀粉酶水解率；利用普魯蘭酶作用支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵使支鏈淀粉脫支成為直鏈片段，獲得CL；利用異淀粉酶作用于α-1,6-糖苷鍵先水解β-限制糊精中大于三個(gè)葡萄糖單位構(gòu)成的側(cè)鏈，再用普魯蘭酶進(jìn)一步水解兩個(gè)以上葡萄糖單位構(gòu)成的側(cè)鏈，這樣經(jīng)過異淀粉酶和普魯蘭酶共同作用后可以使β-極限糊精完全脫支，以此通過計(jì)算得到 A與B 鏈的比值。杜先鋒等[8]測(cè)定葛根支鏈淀粉β-淀粉酶水解率時(shí)，β-淀粉酶用量為500 U，反應(yīng)時(shí)間約48 h，反應(yīng)溫度為37 ℃；測(cè)定A∶B值時(shí)，異淀粉酶用量為2 U，反應(yīng)時(shí)間為15 h，普魯蘭酶用量為0.6 U，反應(yīng)時(shí)間為24 h。敖自華等[9]測(cè)定銀杏支鏈淀粉β-淀粉酶水解率時(shí)，β-淀粉酶用量為500 U，反應(yīng)時(shí)間約44 h，反應(yīng)溫度為37 ℃；測(cè)定CL時(shí)，普魯蘭酶用量為4 U，反應(yīng)時(shí)間約24 h，反應(yīng)溫度為37 ℃；測(cè)定A∶B值時(shí)，異淀粉酶用量為80 U，反應(yīng)時(shí)間為20 h，普魯蘭酶用量為1 U，反應(yīng)時(shí)間為15 h。王素雅等[10]測(cè)定慈姑支鏈淀粉β-淀粉酶水解率時(shí)，β-淀粉酶用量為325 U，反應(yīng)溫度為37 ℃；測(cè)定CL時(shí)，普魯蘭酶用量為3 U，反應(yīng)溫度為37 ℃。本研究表明，0.1 g的稻米支鏈淀粉水解時(shí)，β-淀粉酶的最適用量為500 U，反應(yīng)時(shí)間為48 h，反應(yīng)溫度為37 ℃；測(cè)定CL時(shí)，對(duì)于22 mg的稻米支鏈淀粉，普魯蘭酶的最適用量為4 U，反應(yīng)時(shí)間為24 h，反應(yīng)溫度為37 ℃；對(duì)于1 mL濃度為1 mg/mL的稻米β-極限糊精溶液，先用100 U異淀粉酶對(duì)其進(jìn)行水解，反應(yīng)24 h 后加熱使酶失活，再用1 U普魯蘭酶進(jìn)行第二步脫支水解，反應(yīng)24 h后進(jìn)行A∶B值的測(cè)定可以取得較好的效果。研究結(jié)果對(duì)于了解支稻米鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)，揭示稻米食用品質(zhì)形成的機(jī)理都具有應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本文優(yōu)化了酶法測(cè)定稻米支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的各項(xiàng)反應(yīng)條件。在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行了稻米支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的測(cè)定，8個(gè)參試品種中，β-淀粉酶水解率的變幅為51.22～62.86%，CL的變幅為18.31～20.83，ECL的變幅為11.38～14.82，ICL的變幅為4.57～5.93，A∶B值的變幅為1.05～1.67。

[1]KONG X, ZHU P, SUI Z, et al. Physicochemical properties of starches from diverse rice cultivars varying in apparent amylose content and gelatinization temperature combinations [J]. Food Chemistry, 2015, 172: 433-440

[2]彭小松, 朱昌蘭, 王方, 等. 秈粳雜種后代支鏈淀粉結(jié)構(gòu)及其與稻米糊化特性相關(guān)性分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2014, 28(7): 1219-1225

PENG X S, ZHU C L, WANG F, et al. The relationship between amylopectin structure and rice paste property of Indica/Japonica cross progenies [J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2014, 28(7): 1219-1225

[3]張昌泉, 趙冬生, 李錢峰, 等. 稻米品質(zhì)性狀基因的克隆與功能研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(22): 4267-4283

ZHANG C Q, ZHAO D S, LI Q F, et al. Progresses in research on cloning and functional analysis of key genes involving in rice grain quality [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(22): 4267-4283

[4]YAO Y, THOMPSON D B, GUILTINAN M J. Maize Starch-Branching Enzyme Isoforms and Amylopectin Structure. In the Absence of Starch-Branching Enzyme IIb, the Further Absence of Starch-Branching Enzyme Ia Leads to Increased Branching [J]. Plant Physiology, 2004, 136(3): 3515-3523

[5]胡志萍, 鐘海明, 柳美南, 等. 稻米品質(zhì)形成機(jī)理研究進(jìn)展及水稻品質(zhì)育種技術(shù)策略[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2007, 17(6): 5-11

HU Z P, ZHONG H M, LIU M N, et al. Advance in Forming Regularity of Rice Quality and Its Breeding Technical Strategies [J]. Acta Agriculturae Jiangxi, 2007, 17(6):5-11

[6]VANDEPUTTE G E, DELCOUR J A. From sucrose to starch granule to starch physical behaviour: a focus on rice starch [J]. Carbohydrate Polymers, 2004, 58(3): 245-266

[7]HIZUKURI S. Polymodal distribution of the chain lengths of amylopectins, and its significance [J]. Carbohydrate Research, 1986, 147: 342-347

[8]杜先鋒, 王璋, 許時(shí)嬰. 酶法測(cè)定葛根支鏈淀粉分支化度[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2002, 28(2): 62-65

DU X F, WANG Z, XU S Y, et al. Enzymatic Determination on the Degree of Multiple Branching in Pueraria lobata Amylopectin [J]. Food and Fermentation Industries, 2002, 28(2): 62-65

[9]敖自華, 王璋, 許時(shí)嬰. 銀杏支鏈淀粉分子結(jié)構(gòu)的研究[J]. 食品科學(xué), 2000, 21(10):15-18

AO Z H, WANG Z, XU S Y. Research on the molecular structure of ginkgo amylopectin [J]. Food Science, 2000(21): 15-18

[10]王素雅, 曹崇江, 楊玉玲, 等, 慈菇支鏈淀粉的分離純化及其分子結(jié)構(gòu)研究[J]. 食品科學(xué), 2009(9):29-32

WANG S Y, CAO C J, YANG Y L, et al. Study on separation of arrowhead amylopectin and its molecular structure [J]. Food Science, 2009(9): 29-32

[11]賀曉鵬, 朱昌蘭, 劉玲瓏, 等, 不同水稻品種支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的差異及其與淀粉理化特性的關(guān)系[J]. 作物學(xué)報(bào), 2010. 36(2): 276-284

HE X P, ZHU C L, LIU L L, et al. Difference of amylopectin structure among rice varieties differing in grain quality and its correlations with starch physicochemical properties [J]. Acta Agronomica Sinica, 2010, 36(2): 276-284.