蠐螬抗菌肽的制備及其穩定性研究

王 成，余以剛，張 青，余祥雄，梁澤明

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

近年來，由于濫用抗生素飼料添加劑導致的抗藥性和藥物殘留問題已經嚴重影響到人類健康，尋找一類新型的抗菌藥物是解決該問題的有效途徑。昆蟲抗菌肽是昆蟲免疫后血淋巴中的一類抗菌多肽，它具有分子量小、熱穩定性好、抗菌譜廣的特點，可以抑殺某些真菌、病毒及原蟲，且抗菌機理獨特，不易產生抗藥性［1］。研究表明，抗菌肽具有作為一類新藥開發的巨大潛力，但由于抗菌肽的蛋白性質，很多種類的抗菌肽穩定性特別是酶解穩定性差，制備出穩定性好的抗菌肽具有重要的實際意義。

抗菌肽又稱抗微生物肽，是生物體液免疫的重要防御因子，在昆蟲的先天性免疫系統中發揮重要作用，抗菌肽主要由脂肪體（類似于哺乳動物的肝臟）分泌，其他組織如消化道、氣管、馬氏管和特定的血細胞也能夠產生［2］。當昆蟲體壁受到損傷或被微生物感染后，抗菌肽被迅速合成，并釋放入血淋巴中作用于細菌、病毒、真菌等［3］。其活性維持時間因昆蟲種類不同存在明顯差異［4］。

蠐螬隸屬于鞘翅目（Coleoptera），是金龜甲總科（Scarabaeoedea）幼蟲的統稱，又名地蠶、土蠶［5］。借助現代的醫學以及檢測手段分析得知，蠐螬體內含有各種氨基酸、多肽或蛋白質、糖類、生物堿和羧酸類化合物，以及較高含量的鈣、鐵、銅、錳等礦物元素［6］。近年來的研究表明，蠐螬具有顯著的抗癌抑癌、抗腫瘤［7］、抗氧化［8］、抗衰老和抗病毒、抗菌功效［9］。本研究使用酶解法以加酶量、酶解時間、料液比、pH為因素優化胰蛋白酶酶解蠐螬蛋白制備蠐螬抗菌肽的制備工藝，并研究pH、溫度、鹽濃度等環境因素對蠐螬抗菌肽抗菌效果的影響，為蠐螬資源的深度加工利用和自然抗菌產物研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、角蛋白酶（諾維信公司），脫脂蠐螬（廣東漢肽生物工程有限公司），大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（廣州市菌種保藏中心）。

模擬胃液的配制：取胃蛋白酶3.20 g，NaCl 2.00 g，溶解于1.00 L蒸餾水中，HCl調節pH值至1.20。

模擬腸液的配制：取胰蛋白酶10.00 g，磷酸二氫鉀6.80 g，溶解于1.00 L蒸餾水中，用NaOH調節pH值至7.50。

1.2 試驗方法

1.2.1 堿溶酸提法提取蠐螬蛋白 準確稱取50.00 g脫脂蠐螬樣品，以1∶15（ g/mL）的比例加入750 mL 1.5%的NaOH溶液，于60℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，1 000 r/min下離心10 min，取上清液。往上清液中緩慢倒入8.00 mol/L的HCl，直至不再產生沉淀，1 000 r/min離心力下離心10 min，取沉淀，冷凍干燥待用［10］。

1.2.2 酶解法制備蠐螬抗菌肽 準確稱取5.00 g蠐螬蛋白樣品，按1∶15（ g/mL）比例加入75.00 mL蒸餾水，用0.20 mol/L NaOH和0.20 mol/L HCl將樣品調整到最適pH，按照50.00 ku/g酶活加入蛋白酶，酶解過程中用0.20 mol/L NaOH和0.20 mol/L HCl維持pH。酶解完成后，95℃中水浴15 min，終止酶解反應，5 000 r/min離心5 min，取上清液，得到蠐螬酶解液。

1.2.3 牛津杯法測抑菌活性 以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，采用牛津杯法測定蠐螬酶解樣品抑菌活性［11］。使用LA復活菌株，LB培養，增值菌株。測定時，使用生理鹽水調整菌液濃度至1.00×106CFU/mL。牛津杯直徑為6.00 mm，上樣量為150 μL。抑菌圈直徑越大，抑菌效果越好［12］。

1.2.4 水解度的測定 實驗中水解度的測定按照 pH-stat法測定［13］。

1.2.5 單因素實驗 以抑菌效果（抑菌圈直徑）為指標，在酶解溫度（37℃）恒定的條件下，研究以下4個因素對抗菌肽抑菌效果的影響，實驗重復3次。

加酶量的選擇：準確稱取5份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 ku/g添加胰蛋白酶，酶解時間為60 min，料液比為1∶20（g/mL），pH為8.00的條件下進行酶解，酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標，選擇最佳酶用量。

酶解時間的選擇：準確稱取5份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為40.00 ku/g，料液比為1∶20（ g/mL），pH為8的條件下進行酶解，酶解時間分別為30、60、90、120、150 min。酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標，選擇最佳酶解時間。

料液比的選擇：準確稱取5份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為40.00 ku/g，料液比分別為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（ g/mL），酶解時間為90 min，pH為8的條件下進行酶解，酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標，選擇最佳料液比。

pH的選擇：準確稱取4份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為40.00 ku/g，酶解時間為90 min，料液比為1∶20（ g/mL），pH分別為6.50、7.00、7.50、8.00、8.50的條件下進行酶解，酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標，選擇最佳酶解pH。

1.2.6 正交法優化胰蛋白酶制備抗菌肽條件 在酶解溫度（37℃）恒定的條件下，以加酶量、酶解時間、料液比和酶解pH為因素，分別設置4個水平進行正交實驗［14-15］，優化蠐螬抗菌肽制備條件（表1）。

表1 正交實驗各因素及水平

1.2.7 蠐螬抗菌肽穩定性研究 （1）蠐螬抗菌肽酸堿度穩定性研究。各取酶解產物1.0 mL，用0.2 mol/L NaOH和0.2 mol/L HCl 配制一系列pH值為 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00、13.00的溶液，取100.00 μL樣品進行抑菌實驗。對照實驗組為一系列不同pH值的溶液（不加抗菌肽樣品）。

（2）蠐螬抗菌肽的溫度穩定性研究。各取酶解產物 1.00 mL，分別在 20、30、40、60、80、100℃條件下放置30 min，處理完成后放置至室溫，取100.00 μL樣品進行抑菌實驗。空白對照樣品為無菌蒸餾水。

（3）蠐螬抗菌肽鹽濃度穩定性研究。各取酶解產物1.00 mL，用NaCl 配制一系列鹽濃度為 0、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00、120.00、140.00、160.00、180.00、200.00 mmol/L的溶液，取100.00 μL樣品進行抑菌實驗。對照樣品為一系列不同鹽濃度的溶液（不加抗菌肽樣品）。

（4）蠐螬抗菌肽水解穩定性研究。各取酶解產物1.00 mL，根據上述配制方法比例配制模擬胃液和模擬腸液，分別在37℃中水浴處理30 min，以未處理的抗菌肽溶液和不添加胃/胰蛋白酶的人工胃/胰液為對照。取100.00 μL樣品進行抑菌實驗。

2 結果與分析

2.1 加酶量對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

圖1 加酶量對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

如圖1所示，當加酶量在20.00～40.00 ku/g范圍增加時，蠐螬蛋白酶解產物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果均增強，而當加酶量大于40.00 ku/g時，酶解產物的抑菌效果變弱；加酶量大于80.00 ku/g時，酶解產物對兩種實驗菌幾乎沒有抑制效果。產生這種效果的可能原因是：加酶量增大時，胰蛋白酶對蠐螬蛋白的水解程度增強，將具有抗菌活性的多肽水解為分子量更小的多肽，從而使抗菌肽失去了抗菌活性［16］。

2.2 酶解時間對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

如圖2所示，當酶解時間在30～90 min時，蠐螬酶解產物對實驗菌的抑制效果隨著酶解時間的延長呈現增強的趨勢，當酶解時間超過90 min時，酶解產物的抑菌效果明顯降低。實驗認為，酶解時間為90 min時，酶解產物的抑制效果最好。這是由于長時間的酶解會將抗菌肽酶解為更小的分子，這些小分子肽是不具有抑菌活性的，因此酶解物的抑菌活性會在90 min以后開始下降。

圖2 酶解時間對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

2.3 料液比對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

由圖3可知，在實驗條件內，酶解產物的抑菌效果隨著料液比的增加呈現先升后降的趨勢，當料液比為1∶20 （g/mL）時，胰蛋白酶水解物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。

2.4 pH對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

由圖4可知，在實驗選取的pH范圍內，當pH小于8.00時，胰蛋白酶酶解產物的抑菌效果隨著pH的增大而增加，但當pH為7.50和8.00時，酶解產物的抑制效果沒有明顯改變，當pH大于8.00時，酶解產物的抑菌效果明顯下降，因此pH8.00為制備蠐螬抗菌肽的最佳pH值。

圖3 料液比對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

圖4 pH對蠐螬酶解物抑菌效果的影響

2.5 胰蛋白酶酶解蠐螬蛋白條件優化

從表2可以看出，當蠐螬蛋白酶解度為15.21%、15.61%和16.03%時，酶解液對兩種實驗菌的抑制效果差別不大，分別為9 mm和11 mm左右。當酶解度較低如10.11%時，對實驗菌株的抑制效果不佳，可能是由于酶解程度不夠；當酶解程度較高如20.01%時，對實驗菌株的抑制效果也不是最好，可能是由于酶解程度過高，抗菌肽片段太短造成的。通過極差分析可知，各因素對蠐螬蛋白酶解度的影響效果不一樣，各因素的顯著性依次為加酶量（A）>酶解時間（B）>pH（D）>料液比（C），胰蛋白酶酶解蠐螬蛋白實驗中各實驗因素影響金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制效果的主次順序為：加酶量（A）＞酶解時間（B）＞料液比（C）＞ pH（D）。

表2 胰蛋白酶作用效果正交試驗L16

對大腸桿菌而言，胰蛋白酶酶解制備抗菌肽的最優水平組合為A2B1C2D3和A2B3C4D1即當加酶量為40.00 ku/g、酶解時間為30 min、料液比為1∶15 （g/mL）、pH為8.00時，以及當加酶量為40.00 ku/g、酶解時間為90 min、料液比為1∶25、pH為7.00時，酶解產物對大腸桿菌的抑制效果最好，兩種酶解條件下，得到的酶解產物對大腸桿菌的抑菌圈直徑達到最大，為9.00 mm（牛津杯直徑為6.00 mm），這種條件下獲得的酶解產物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為10.50、10.60 mm。

對金黃色葡萄球菌而言，胰蛋白酶酶解制備抗菌肽的最優水平組合為A3B3C1D2，即當加酶量為50.00 ku/g、酶解時間為90 min、料液比為1∶10 （g/mL）、pH為7.50時，酶解產物對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑達到最大，為11.50 mm，而酶解產物對大腸桿菌的抑菌圈直徑為8.70 mm。這與Tsukiyama等［17］的研究結果基本一致，其原因可能與革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞結構有關［18-19］。

為了制備具有更好抑制效果的蠐螬抗菌肽，將酶解脫脂蠐螬蛋白制備抗菌肽的各因素最優水平組合確定為A3B3C1D2，即以加酶量為50.00 ku/g、酶解時間為90 min、料液比為1∶10（g/mL）、pH為7.50的條件酶解制備蠐螬抗菌肽。此時制備的酶解產物對E.coli和S.A的抑菌圈直徑分別為8.70、11.50 mm。

2.6 蠐螬抗菌肽的環境穩定性

從圖5可以看出，蠐螬抗菌肽在pH為6.00的環境下，抑菌活性最好，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈為11.80 mm，對大腸桿菌的抑菌圈為9.00 mm。當pH增加到8時，抗菌肽的抑菌活性急劇下降。這與抗菌肽的蛋白特性有關，只有當pH小于蛋白質等電點時，抗菌肽分子的凈電荷才為正；而當pH大于等電點時，抗菌肽分子凈電荷為零甚至為負，起不到抗菌的作用。

圖5 不同pH下蠐螬抗菌肽的抑菌活性

圖6表示的是蠐螬抗菌肽經過不同溫度處理30 min后，抑菌活性隨溫度的變化情況，由于在不同的pH值條件下，蠐螬抗菌肽的抑菌活性會隨pH值的改變而改變，故在溫度穩定性試驗時將pH調整到6.00。蠐螬抗菌肽在低于100℃的溫度處理下，仍然保持原有的抗菌活性，而當處理溫度超過100℃時，抗菌肽的抑菌活性開始出現明顯下降。表明蠐螬抗菌肽能在高溫下保持抑菌活性，具有一定的熱穩定性。

圖6 不同溫度下蠐螬抗菌肽的抑菌活性

據報道，環境中的鹽濃度對抗菌肽的抗菌活性也有很大影響。從圖7可以看出，對于不同的細菌，鹽濃度對抗菌肽的抑菌活性影響不同。對金黃色葡萄球菌而言，當鹽濃度超過140.00 mmol/L，抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯減弱，而且隨著鹽濃度的升高，抑制活性降低；當鹽濃度大于80.00 mmol/L時，抗菌肽對大腸桿菌的抑制活性隨著鹽濃度的增加而明顯減弱，當鹽濃度大于180.00 mmol/L時，抗菌肽對大腸桿菌基本沒有抑制效果。

圖7 鹽濃度對蠐螬抗菌肽抑菌活性的影響

由于抗菌肽的蛋白特性，實驗研究了蠐螬抗菌肽的耐胃蛋白酶和耐胰蛋白酶水解情況。空白對照表示的是蠐螬抗菌肽在水溶液中對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果。由圖8可知，蠐螬抗菌肽在不含胃蛋白酶的模擬胃液中，對實驗菌的生長抑制效果有所減弱，而在不加胰蛋白酶的模擬腸液中，抗菌肽對實驗菌的生長抑制效果不變。這是由于模擬胃/腸液中各因素綜合影響的結果。抗菌肽經過胃蛋白酶處理之后，其對實驗菌的抑制效果完全消失；但經過胰蛋白酶處理之后的抗菌肽對實驗菌的生長抑制效果略微減弱。表明蠐螬抗菌肽沒有抗胃蛋白酶水解的能力，但有較強的抗胰蛋白酶水解能力。

圖8 蠐螬抗菌肽的水解穩定性

3 結論與討論

本研究通過酶解法制備出對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抗菌效果的蠐螬抗菌肽，優化了胰蛋白酶酶解制備抗菌肽的酶解條件，并研究了蠐螬抗菌肽的穩定性，得出以下結論：

胰蛋白酶制備蠐螬抗菌肽的最適條件是加酶量為50.00 ku/g，酶解時間為90 min，料液比為1∶10 （g/mL），酶解pH為7.50。此時，蠐螬蛋白的水解度為15.21%，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制直徑分別為11.50 mm和8.70 mm。蠐螬抗菌肽的酸穩定性比較好，但是不具有堿穩定性，最佳pH為6.00；蠐螬抗菌肽具有較好的耐熱穩定性；鹽濃度對不同的實驗菌，影響不同，對大腸桿菌而言，當溶液中的鹽濃度大于80.00 mmol/L時，抗菌肽的抑制效果逐漸減弱；對金黃色葡萄球菌而言，當溶液中鹽濃度大于180.00 mmol/L時，抗菌肽的抑制效果才開始出現明顯下降。蠐螬抗菌肽具有良好的耐胰蛋白酶水解穩定性，但不具有耐胃蛋白酶水解穩定性。

在本研究中，用胰蛋白酶制備得到蠐螬抗菌肽，實現了昆蟲資源的有效利用，但制備的蠐螬抗菌肽還只是初步的酶解混合物，抑菌效果還沒有達到抗生素的效果，后續工作將對酶解產物進行分離純化，以提高抗菌效果；另外，制備的抗菌肽雖然有良好的耐胰蛋白酶水解穩定性，但不具有耐胃蛋白酶水解穩定性，因此下一步工作將對抗菌肽進行改性或者制成納米粒子以提高抗菌肽的穩定性。

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