一種捕獲尿液中膀胱癌細胞的新型微流控芯片的設計

耿春陽，李馳宇，李雅楠，任海軍，翟曉峰，劉波

1.大連理工大學 生物醫學工程系，遼寧 大連 116024；2.大連市友誼醫院 普外科，遼寧 大連 116024；3.銳意微流控醫療科技（常州）有限公司，江蘇 常州 213111

引言

膀胱癌是指發生在膀胱粘膜上的惡性腫瘤，是我國泌尿外科臨床上最常見的腫瘤之一。膀胱癌患者可表現出多種癥狀，如血尿、尿急、尿頻、盆腔疼痛等，而90%以上的膀胱癌患者最初的臨床表現癥狀是血尿，然而出血量與血尿持續時間的長短，與腫瘤的惡性程度和大小沒有明顯關系，這是膀胱癌高致死率的重要原因[1]。如果早期發現，膀胱癌5年生存率大概為94%，可見膀胱腫瘤的早期診斷可以極大地降低膀胱癌的致死率[2]。目前臨床上對于有尿路癥狀患者的出診篩查和對膀胱癌術后患者的復查主要手段有尿脫落細胞學檢查、膀胱鏡檢查、尿路造影術和熒光原位雜交（Fluorescent in Situhybridization，FISH）等技術。其中尿脫落細胞學檢查屬于無創檢測，但是其敏感性較低[3]；膀胱鏡檢查屬于有創檢測[4]；尿路造影術不支持活檢[5]；FISH技術費用過高[6]。因此，亟需一種新的無創檢測方法，既擁有較高的敏感性和特異性，同時費用低廉，足以讓大部分患者可以承受。

應用于腫瘤細胞檢測的微流控芯片技術在近十年逐漸出現[7]。為了實現腫瘤細胞的檢測，首先必須完成在微流控芯片內對腫瘤細胞的高效抓捕。細胞捕獲的手段有很多，目前微流控芯片用到的細胞捕獲技術主要基于光學、電學、流體力學以及抗原抗體結合等原理，通過微流控芯片內部的特殊結構和其他的技術相結合也是常用的方法。高菊逸等[8]設計出一種簡易的用于循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell，CTC）捕獲的一種玻璃—聚二甲硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）型芯片。首先，玻片表面經過氧等離子、硅烷化處理，使玻片表面能夠固定特異性抗體；然后通過抗原抗體特異性結合捕獲靶細胞，捕獲率可高達92%。巧妙的結構設計同樣可以用于細胞的捕獲。Stott等[9]在芯片中設計出了一種人字形結構用于CTC的捕獲，這種結構讓血液樣品在微流控芯片中充分混合以增加CTC的捕獲效率，最后成功地在患有前列腺癌患者的血液樣品中捕獲觀察到了CTC。但截止目前，尚未見通過尿液抓捕檢測膀胱癌細胞的相關報道。

本文基于微流控芯片技術，通過設計芯片內部特殊的抓捕結構，結合抗原抗體吸附反應特異性，探究抗體固定在芯片內表面的最佳條件，實現從尿液樣品中特異抓捕和鑒定膀胱癌細胞。

1 材料與方法

1.1 芯片設計與制備

結合目前已經成熟的捕獲腫瘤細胞的方法，設計中將抗原抗體免疫吸附反應原理結合到微流控芯片上，使其能夠準確檢測尿液樣品中可能出現的膀胱癌細胞，以此作為標準來判斷患者是否患有膀胱癌。芯片的流體通道結構，見圖1。通道結構主要由尿液樣本入口、尿液樣品檢測單元和尿液樣本出口組成。

圖1 微流控芯片流體通道結構平面圖

在檢測單元中，設置有半徑為25 μm的圓柱體陣列。其中每一行相鄰圓柱之間圓心間隔100 μm；相鄰兩行圓柱之間圓心所在直線平行；圓柱體陣列交錯分布，間隔100 μm。圓柱體陣列之間的間隔恰好足夠腫瘤細胞通過并且可以起到延長實驗時間、減緩流速以及增加膀胱癌細胞的捕獲效率等一系列的作用。

該微流控芯片是透明的玻璃—PDMS芯片，所有通道和腔室采用PDMS（沈陽力天利源商貿有限公司）作為材料，并與0.17 mm厚度的玻璃片鍵合密封，構成玻璃—PDMS芯片。

1.2 抗體固定條件探究

本文采用基于抗原抗體免疫吸附反應的方式抓捕并鑒定膀胱癌細胞，首先探究最適宜的抗體固定條件。采用氨丙基三乙氧基硅烷（Aminopropyltriethoxysilane，APTES）硅烷化修飾玻片表面，使其具有固定蛋白質抗體的能力。為了探究最佳的修飾玻片條件，本文使用異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）標記的熒光抗體進行實驗，在顯微鏡下觀察拍照后使用圖像處理軟件計算熒光強度，以熒光強度代表被固定在玻片表面的抗體量。將硅烷化玻片的時間分別設定為1、5和20 min，在其他實驗條件完全相同的狀況下進行實驗，觀察熒光強度并分析。隨后在硅烷化時間相同的情況下，將抗體孵育的時間分別設定為1.5、2和2.5 h，再次觀察熒光強度并分析。

1.3 膀胱癌樣品鑒定

取膀胱癌患者18例的病理組織作切片（大連市友誼醫院）作為驗證，病理切片采用經典的蘇木精—伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin Staining，HE）進行染色，通過常規組織形態學判斷是否是膀胱癌組織。同時取50 mL膀胱癌患者的尿液樣品，置于臺式高速低溫離心機中以800 G離心力離心10 min，小心去除上清廢液。將離心后得到的細胞置于玻璃底培養皿中，采用免疫熒光進行膀胱癌細胞的鑒定。在玻璃底培養皿里加入膠原促使細胞粘附在玻璃底上，在顯微鏡下觀察確認細胞的存在后向培養皿內加入1:200 磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Solution，PBS）稀釋的膀胱癌細胞特異性抗體Rabbit Anti-CD15 antibody，將玻璃底培養皿置于濕盒中4℃過夜；隨后取出培養皿，使用PBS清洗3遍洗去多余的一抗，隨后向培養皿中加入1:100 PBS稀釋的FITC標記的熒光二抗Anti-Rabbit IgG，在37℃培養箱中孵育1～2 h之后置于熒光顯微鏡下觀察是否有帶熒光的細胞。

1.4 膀胱癌細胞的抓捕鑒定

將1:100 PBS稀釋的CD15抗體通入芯片里面孵育2 h，確保抗體固定在芯片的檢測單元區域。隨后將離心得到的膀胱癌細胞懸浮液通入到芯片里面并在37℃培養箱中孵育2 h。由于膀胱移行上皮癌在所有膀胱癌中的比例超過90%[10]，所以本研究中使用膀胱移行上皮癌對應的特異性熒光一抗來鑒定膀胱癌細胞，即向芯片內灌注1:100 PBS稀釋的膀胱移行上皮癌細胞特異性熒光一抗。在37℃培養箱中孵育2 h后用PBS洗去多余的熒光一抗，置于熒光顯微鏡下觀察是否有帶熒光的細胞。

1.5 圖像分析與數據處理

使用ImageJ軟件（National Institutes of Health）處理得到的熒光圖像，可以得到熒光強度的具體數值。首先將所得熒光圖片導入軟件，計算各點的熒光強度，排除熒光強度為0的點之后將所得熒光強度相加除以參與計算的熒光點的個數，得到該幅圖像的平均熒光強度；然后重復該步驟得到5幅圖像的平均熒光強度作為一組實驗數據與其他條件下的實驗數據相比較。所得數據采用Execl（Microsoft，USA）統計平均值與標準差，組間數據通過t-Test進行比較，P＜0.05視為存在差異顯著。

2 實驗結果

2.1 硅烷化時間與抗體孵育時間對抗體固定效果的影響

通過實驗對比發現在硅烷化時間過長的情況下，APTES容易發生氧化反應而喪失結合蛋白的能力；而如果硅烷化時間過短，則硅烷化并不徹底，也并不利于抗體在玻片上的固定（圖2）。在進行了多組數據對比后，發現硅烷化時間為5 min時，抗體的固定效率最高，與其余組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 硅烷化時間與熒光強度的關系

通過實驗對比發現如果孵育時間太短，抗體并不能完全與硅烷化后的玻片充分結合導致固定抗體的量不足；然而孵育時間太長，抗體在玻片上富集可能導致抗體結構改變而造成其功能喪失（圖3）。在進行了多組數據對比后，可以看出實驗結果與預期相符合，在孵育時間為2 h時，熒光強度最大，抗體的固定效率最高。與其余各組比較，差異均有統計性意義（P＜0.05）。

圖3 熒光強度與抗體孵育時間的關系

2.2 膀胱癌樣品鑒定

不同放大倍率物鏡下的膀胱癌患者的病理切片典型形態，見圖4。癌細胞的細胞核顯著增大，進而出現核胞質失調的現象，同時其細胞核出現畸形。此外，由于癌細胞DNA大量增加，染色質明顯增多，染色呈藍紫色似墨滴狀。證明所取樣本為典型的膀胱癌樣本。

圖4 膀胱癌患者病理切片

然后對離心后的18例尿液樣品進行免疫熒光鑒定，由于尿液樣品中的腫瘤細胞形態并不標準，而且有些病理組織碎片也能非特異性地結合抗體并發出綠色熒光，因此需要對比其白光下的照片進一步確認其是否為膀胱癌細胞，并在不同倍數的顯微鏡下反復觀察確認。結果顯示，18例樣品中，有11例檢出了帶有綠色熒光的細胞。離心后的樣本細胞，經過免疫熒光鑒定后，在白光下的圖片和激發光下的圖片，見圖5。說明從醫院得到的尿液樣品中含有膀胱癌細胞，而且所選抗體可以特異性識別膀胱癌細胞，可用于后續的芯片內鑒定實驗。

圖5 膀胱癌細胞鑒定結果

2.3 膀胱癌細胞的抓捕鑒定

在芯片捕獲單元內部進行膀胱癌細胞的特異性抓捕實驗，結果見圖6。在加入熒光抗體并置于熒光顯微鏡下觀察之后，11例帶有腫瘤細胞的病人樣品中，都有被捕獲的細胞、各種組織以及細胞碎片發出綠色熒光，說明固定于玻片上的抗體特異性地捕獲了腫瘤細胞以及與其相關的組織碎片等。

圖6 芯片內膀胱癌細胞的抓捕鑒定

3 討論

近年來，微流控芯片技術的發展為癌細胞檢測的研究提供了很多新的思路，但是現在主要的實驗研究仍然不能很好地還原癌細胞生存的復雜環境。很多實驗選用實驗室培養的癌細胞進行芯片的抓捕鑒定實驗，其檢測特異性可以比臨床高出數倍[11-12]。但是癌細胞存在的真實環境往往比較復雜，比如本研究中膀胱癌患者的癥狀之一是血尿，大量的血細胞將大大增加癌細胞抓捕鑒定的難度，也在一定程度上降低了實驗的特異性。微流控芯片作為一個新型的無創檢測平臺，具有高度的可行性和可重復性，本研究設計的這種微流控芯片制作簡單、成本低廉、適用于一次性使用并且能夠有效提升臨床檢測的效率。

在利用微流控芯片實現對膀胱癌細胞抓捕鑒定的過程中，特異性抗體結合到特定的檢測單元區域是芯片功能實現的重要內容。抗體作為一種蛋白質，并不能長時間保存，而且變性之后的抗體也不能再用于特異性抗原的鑒定[13]，因此需要探究出最適宜的抗體固定條件。由于微流控芯片需要和潔凈的0.17 mm厚的蓋玻片鍵合，流體通道的底部是玻璃而四周和頂部是PDMS，所以只需將抗體固定在玻璃片上，檢測單元便具備了特異性抓捕和鑒定特定腫瘤細胞的能力。常用的修飾玻片表面方法有多聚賴氨酸修飾[14]、納米修飾[15-16]、以及戊二醛修飾[17-18]等。其中APTES修飾效果比較明顯，且易于工藝化操作，所以采用APTES修飾玻片表面使其具有固定蛋白質抗體的能力。

在使用微流控芯片對膀胱癌患者尿樣中的膀胱癌細胞進行抓捕鑒定之前，先在培養皿里利用傳統免疫熒光方法對膀胱癌細胞進行提取鑒定。該方法雖然也能夠無創檢測鑒定膀胱癌細胞，但本文采用的微流控芯片方法與這種傳統免疫熒光方法相比，具有以下優勢：① 通過微流控芯片進行膀胱癌細胞抓捕與鑒定，消耗的試劑量僅需微升級別，成本低；② 在微流控通道中，熒光強度容易進行定量檢測與計算，而在培養皿難以實現；③ 微流控芯片更易實現大規模批量生產和自動化檢測。

在實際的實驗過程中也發現，由于微流控芯片內部尺寸微小，通常芯片內流通的樣本量只有幾十微升，而膀胱癌細胞在尿液樣品中的數量又較為稀少，在實際檢測中并不能實現每次實驗都能夠特異性地抓捕到膀胱癌細胞。經過數十次反復實驗發現，調整灌注的速度和灌注的時間可以使實驗結果得到明顯改善。灌注速度太快，會導致抗體與樣品中膀胱癌細胞接觸的時間不足從而難以抓捕到膀胱癌細胞；灌注時間太短會導致進入芯片的樣品量太少，也就導致進入芯片的膀胱癌細胞的數量十分稀少。在優化了灌注速度與灌注時間之后，雖然不能確保樣品中的所有膀胱癌細胞都被特異性捕獲，但是每次實驗都能特異性地捕獲到樣品中膀胱癌細胞。另外，在實驗中也發現了一些其他的不足之處，例如有時用于攔截細胞的PDMS陣列偶爾會非特異性地吸附一些細胞或者組織碎片，導致芯片捕獲到的細胞并非全都是膀胱癌細胞，不過這種非特異性的干擾可以通過本文采用的抓捕和鑒定兩種不同特異抗體交叉重復來排除，即固定在芯片內部表面的一種特異性抗體抓捕樣本中的膀胱癌細胞，而通過針對另一種標志性蛋白的帶熒光的特異性抗體再與之結合。非特異吸附的細胞或者組織碎片不能與帶熒光的特異性抗體結合。因此通過對比熒光與白光照片，即可排除非特異性干擾，并不影響到芯片實際功能的實現。

本文設計制備的微流控芯片具備了高特異性、低成本、無創檢測和能夠顯微鏡下觀察等一系列優點。整個微流控芯片制作的方法簡單、透光性良好、特異性抓捕效果良好。該微流控芯片的成功設計和制備，豐富了臨床上針對膀胱癌檢測和復查的手段，彌補了一些傳統方法的缺陷，為臨床診斷提供了現有的模型和更廣闊的思路。

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