分析包裝條件對(duì)小黃魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的影響

黃佳奇，向迎春，邵穎，楊水兵，胡亞芹，，*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058；2.浙江大學(xué)舟山海洋研究中心，浙江舟山316021）

水產(chǎn)品是人類(lèi)不可或缺的食品之一，2016年全國(guó)全年水產(chǎn)品產(chǎn)量近7 000萬(wàn)噸，比上年增長(zhǎng)3.0%[1]，伴隨著生活水平的提高，大眾對(duì)水產(chǎn)品的需求和要求也將越來(lái)越高。水產(chǎn)品含水量高、含氮物質(zhì)豐富，加上魚(yú)鰓、內(nèi)臟處黏液是天然的微生物培養(yǎng)基，極易滋生腐敗微生物和病原菌，使魚(yú)體產(chǎn)生酸敗味和腥臭味[2]，這成為影響水產(chǎn)品品質(zhì)的首要因素。上世紀(jì)末有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，貯藏初期某些微生物數(shù)量和比例并不占明顯優(yōu)勢(shì)，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，這些微生物易適應(yīng)環(huán)境變化而大量繁殖，在數(shù)量與比重上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其他菌種所占比例明顯減少或不再繁殖，據(jù)此提出了優(yōu)勢(shì)腐敗菌（Specific spoilage organisms，SSOs）的概念[3]。隨后有關(guān)水產(chǎn)食品SSOs的研究如火如荼，甚至擴(kuò)展到其他食品領(lǐng)域，如肉類(lèi)、果蔬類(lèi)[4-6]等。

SSOs的種類(lèi)與多種因素有關(guān)，最重要的是包裝條件和溫度[7]。SSOs鑒定方法有兩種，培養(yǎng)基分離鑒定和分子生物學(xué)鑒定，前一種方法需要利用培養(yǎng)基進(jìn)行單菌落分離，操作復(fù)雜且無(wú)法檢測(cè)不可培養(yǎng)微生物[8]，但目前仍廣泛應(yīng)用。高通量測(cè)序作為一種新型分子生物學(xué)技術(shù)較多地應(yīng)用于腐敗菌菌相的檢測(cè)，能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定。小黃魚(yú)作為中國(guó)三大海產(chǎn)品之一，極易發(fā)生腐敗變質(zhì)，而其相關(guān)研究卻非常少。本課題以小黃魚(yú)為原料，采用培養(yǎng)基分離法和高通量測(cè)序技術(shù)，探究包裝條件對(duì)4℃冷藏（4℃更接近實(shí)際情況）小黃魚(yú)SSOs的影響，為后期針對(duì)性抑菌，延長(zhǎng)小黃魚(yú)貨架期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

舟山小黃魚(yú)（50 g/尾～70 g/尾）：購(gòu)于浙江省舟山市沈家門(mén)碼頭，選取的小黃魚(yú)外形完整，無(wú)明顯機(jī)械損傷，色澤較為艷麗。采用碎冰泡沫箱包裝并在5 h內(nèi)運(yùn)輸至杭州。

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（Soybean-Casein Digest Agar Medium，TSA）、假單胞選擇性培養(yǎng)基（Pseudomonas CFC Selective Agar，CFC）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（Violet Red Bile Glucose Ager，VRBGA）、貝爾德-帕克瓊脂（Baird-Parker Ager，BP）、乳酸菌培養(yǎng)瓊脂（Man Rogosa Sharpe Ager，MRS）：青島海博生物技術(shù)有限公司；離心柱細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司；2×Planta Max Master Mix：南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

YS-DQ-400立式真空包裝機(jī)：杭州永創(chuàng)智能設(shè)備有限公司；DT-6D氣調(diào)包裝機(jī)：大江機(jī)械設(shè)備有限公司；I Mix均質(zhì)機(jī)：法國(guó)InterLab有限公司；HE-120核酸電泳儀：上海天能科技有限公司；VS-F PCR儀：杭州瀚基科技有限公司；5418R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

小黃魚(yú)用清水清洗后，分別用無(wú)菌袋、真空袋和氣調(diào)包裝盒（氣體比例為N2∶CO2=1∶1）包裝，每種包裝條件下各8批，每批3條魚(yú)均獨(dú)立包裝，置于4℃冰箱，每隔1天取出2條小黃魚(yú)分別進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和菌落總數(shù)測(cè)定。

1.3.2 菌落總數(shù)測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[9]，于無(wú)菌條件下切取5.0 g腐敗魚(yú)皮（這里的魚(yú)皮是指用鑷子撕下來(lái)后，魚(yú)皮和魚(yú)肉都有，內(nèi)臟因?yàn)椴皇秤貌豢紤]計(jì)數(shù)）置于均質(zhì)袋中，加入45 mL無(wú)菌生理鹽水，均質(zhì)5 min，進(jìn)行梯度稀釋，選取適宜的稀釋度吸取1 mL，TSA培養(yǎng)基傾注搖勻，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，置于27℃條件下培養(yǎng)48 h[10]，選取菌落數(shù)在30～300之間的平板作為有效平板，樣品中細(xì)菌總數(shù)（Total viable count，TVC）用每克樣品中菌落形成單位表示（CFU/g）。

1.3.3 感官評(píng)定

感官評(píng)價(jià)參考Li[11]的方法并稍作改動(dòng)。由12名實(shí)驗(yàn)室成員組成評(píng)定小組，以新鮮小黃魚(yú)作為對(duì)照，從色澤、質(zhì)構(gòu)、氣味角度進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其中外觀色澤占20%，黏液量、背部組織和腹部組織各占15%，氣味占35%，去掉最高分和最低分后計(jì)算加權(quán)平均分。其中以5分為感官接受臨界點(diǎn)（貨架期），低于5分表示魚(yú)已腐敗不可食用。小黃魚(yú)感官評(píng)定表見(jiàn)表1。

表1 小黃魚(yú)感官評(píng)定表Table 1 Sensory evaluation standards of little yellow croaker

1.3.4 DNA提取與擴(kuò)增

提?。簠⒖键S林和Parlapani[4，12]的方法并作改動(dòng)。感官評(píng)分達(dá)到5分時(shí)，取該貯藏天數(shù)的小黃魚(yú)樣品，前處理同1.3.2操作。培養(yǎng)基分離法：每個(gè)稀釋度取200 μL菌液，分別涂布于事先晾干的培養(yǎng)基中（TSA、CFC、BP、MRS、VRBGA、孟加拉紅），每個(gè)梯度做 3個(gè)平行。培養(yǎng)條件設(shè)置如下：TSA 25℃培養(yǎng)48 h；CFC 25℃培養(yǎng) 48 h；MRS 25℃培養(yǎng) 72 h；VRBGA 37℃培養(yǎng) 24 h；BP 37℃培養(yǎng)48 h；孟加拉紅37℃培養(yǎng)72 h。選取有一定菌落且不互相重疊的平板，根據(jù)色澤、形態(tài)、隆起度、光滑度等挑取典型的單菌落，反復(fù)進(jìn)行平板劃線，得到純化的單菌落后保存接種至30 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，并于27℃下培養(yǎng)18 h。擴(kuò)增后的單菌液用于DNA提取。高通量測(cè)序法；直接取小黃魚(yú)樣品細(xì)菌稀釋液進(jìn)行DNA提取。兩者均使用Tiangen細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。

擴(kuò)增:培養(yǎng)基分離法以 27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）與 1492r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）為引物:高通量測(cè)序法以338f（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） 與 806r （5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）為引物。兩者反應(yīng)體系均為:2×Planta Max Master Mix 25 μL，引物各 2 μL，模板3 μL，ddH2O 18 μL；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，變性退火延伸重復(fù)35個(gè)循環(huán)，最后72℃徹底延伸5 min。PCR產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.5 測(cè)序與分析

培養(yǎng)基分離法：將純度合格的DNA樣品送至上海生工有限公司測(cè)序。使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中的BLAST對(duì)各菌株序列分析比對(duì)，選取同源性在98%以上的菌株序列。

高通量測(cè)序法：測(cè)序、序列優(yōu)化、可操作分類(lèi)單元（Operational Taxonomy Unit，OTU）種屬鑒定和分類(lèi)分析委托南京諾唯贊生物科技有限公司進(jìn)行，參考數(shù)據(jù)庫(kù)為 RDP 數(shù)據(jù)庫(kù)（Ribosomal Database Project）、Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI 16SMicrobial數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)分

感官評(píng)價(jià)是判斷食品品質(zhì)的重要手段之一，根據(jù)人們的味覺(jué)、嗅覺(jué)、視覺(jué)、觸覺(jué)等對(duì)食品的色香味形等進(jìn)行主觀評(píng)分，根據(jù)評(píng)分結(jié)果判斷食品優(yōu)劣程度[13]。3種包裝條件下小黃魚(yú)的感官評(píng)分如圖1所示。

圖1 不同包裝條件下冷藏小黃魚(yú)感官評(píng)分變化情況Fig.1 Sensory evaluation of refrigerated little yellow croaker under various conditions during storage

空氣、真空和氣調(diào)包裝下小黃魚(yú)的貨架期分別為4、6、10 d。第 0天時(shí)魚(yú)肉的評(píng)分為（9.30±0.86）分，等級(jí)為非常新鮮，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，新鮮度逐漸降低?？諝饨M小黃魚(yú)的從貯藏第2天開(kāi)始腐臭味逐漸增強(qiáng)，表皮逐漸變黏稠；真空組小黃魚(yú)的腐臭味從第4天出現(xiàn)，并逐漸增強(qiáng)，其表皮黏液量也逐漸增多，而組織結(jié)構(gòu)相關(guān)的評(píng)分變化很?。粴庹{(diào)組小黃魚(yú)其組織結(jié)構(gòu)因失水而皺縮導(dǎo)致彈性下降，腐臭味從第6天開(kāi)始出現(xiàn)，但腐臭味強(qiáng)度不及另外兩組，整個(gè)貯藏期間都沒(méi)有明顯的黏液產(chǎn)生（P＜0.05）。

結(jié)果表明包裝條件對(duì)小黃魚(yú)貨架期有明顯的影響，不同包裝條件主要為O2和CO2含量的差異，即O2和CO2含量會(huì)影響微生物的種類(lèi)和代謝速率，從而造成貨架期的不同[14]。

2.2 菌落總數(shù)測(cè)定

3種包裝條件下小黃魚(yú)菌落總數(shù)隨貯藏時(shí)間的變化情況如圖2所示。

圖2 3種包裝條件下冷藏小黃魚(yú)菌落總數(shù)隨貯藏時(shí)間的變化情況Fig.2 Changes of total valuable counts of refrigerated little yellow croaker under various conditions during storage

初始狀態(tài)下的菌落總數(shù)為4.01 lg（CFU/g），貯藏前10天里菌落總數(shù)呈指數(shù)式增長(zhǎng)，第10到14天增長(zhǎng)速度明顯放緩。貯藏末期空氣組、真空組和氣調(diào)組小黃魚(yú)的菌落總數(shù)分別達(dá)到 8.42、8.00、7.55 lg（CFU/g）。在貯藏2 d至6 d內(nèi)，空氣組小黃魚(yú)的菌落總數(shù)呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)并逐步放緩的趨勢(shì)，顯示微生物數(shù)量漸趨飽和狀態(tài)；真空組和氣調(diào)組小黃魚(yú)的菌落總數(shù)增長(zhǎng)出現(xiàn)了明顯的放緩，真空組在第4天出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)，氣調(diào)組在第6天出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)，隨后菌落總數(shù)又呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)，原因可能是這段貯藏期內(nèi)，微生物因缺少O2、高濃度CO2這等限制因素，導(dǎo)致缺氧而無(wú)法存活或轉(zhuǎn)而厭氧呼吸。出現(xiàn)拐點(diǎn)表示厭氧微生物在沒(méi)有需氧微生物的競(jìng)爭(zhēng)后占據(jù)主導(dǎo)地位，開(kāi)始新一輪強(qiáng)烈的代謝活動(dòng)。推測(cè)在貯藏后期3種包裝條件下的腐敗菌菌相組成會(huì)存在比較大的差異。菌落總數(shù)結(jié)合感官評(píng)分可以看出，在感官評(píng)價(jià)終點(diǎn)時(shí)（得分≤5），對(duì)應(yīng)的腐敗微生物數(shù)量均介于 6.5 lg（CFU/g）～7.5 lg（CFU/g）之間，感官評(píng)分與菌落總數(shù)之間存在著顯著的相關(guān)性（P＜0.05）。

2.3 DNA提取與擴(kuò)增

培養(yǎng)基分離法：空氣組從VRBGA、CFC和MRS中分別分離出3株、1株和1株腐敗菌，編號(hào)A1～A5；真空組從VRBGA、CFC和MRS中分別分離出3株、2株和1株腐敗菌，編號(hào)V1～V6；氣調(diào)組從VRBGA、CFC和MRS中分別分離出2株、1株和1株菌，編號(hào)M1～M4，其他選擇性培養(yǎng)基中均沒(méi)有微生物生長(zhǎng)。單菌培養(yǎng)提取DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA后，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)基分離法篩選的腐敗菌16s rDNA電泳圖Fig.3 Electrophoregram of bacterial 16s r DNA

圖4 16S rDNA V3～V4可變區(qū)電泳圖Fig.4 Electrophoregram of V3～V4 variable DNA area

圖5 培養(yǎng)基分離測(cè)得3種包裝下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌組成Fig.5 Composition of SSOs in 3 conditions by culture-dependent method

圖6 高通量測(cè)序法測(cè)得3種包裝下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌組成Fig.6 Composition of SSOs in 3 conditions by culture-independent method

高通量測(cè)序法：將3種包裝條件下小黃魚(yú)表皮腐敗菌懸液直接進(jìn)行DNA提取，并PCR擴(kuò)增V3～V4可變區(qū)，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如如圖4所示。

2.4 腐敗菌檢測(cè)結(jié)果分析

培養(yǎng)基分離法空氣包裝（Culture dependent method-Aerobic condition，CA）、真空包裝（Culture dependent method-VP condition，CV）和氣調(diào)包裝（Culture dependent method-MAP condition，CM）小黃魚(yú) SSOs組成如圖5所示；高通量測(cè)序法空氣包裝（High-throughput sequencing-Aerobic condition，HA），真空包裝（High-throughput sequencing-VP condition，HV） 和氣調(diào)包裝（High-throughput sequencing-MAP condition，HM）小黃魚(yú)SSOs組成圖6所示，高通量測(cè)序結(jié)果只顯示占比1%以上的腐敗微生物。結(jié)果顯示高通量測(cè)序法測(cè)得的腐敗微生物數(shù)量和種類(lèi)要遠(yuǎn)超培養(yǎng)基分離法，且包裝條件也會(huì)對(duì)SSOs組成產(chǎn)生較大差異，空氣條件下SSOs以需氧型為主，真空和氣調(diào)包裝下的SSOs主要以兼性厭氧型為主。

Shewanella glacialipiscicola是唯一一種所有條件下都檢測(cè)到的腐敗菌，培養(yǎng)基分離法檢測(cè)該腐敗菌所占比例要高于高通量測(cè)序法，可能是培養(yǎng)基過(guò)濾了不可培養(yǎng)腐敗菌。希瓦氏菌屬是生鮮肉食品常見(jiàn)的SSOs之一，在自然界中分布廣泛，其適應(yīng)力強(qiáng)，可通過(guò)調(diào)整其嗜鹽能力來(lái)適應(yīng)環(huán)境，是自然條件下海鱸魚(yú)[10]、大菱鲆[15]，真空包裝白蝦[16]，氣調(diào)包裝三文魚(yú)[17]等的SSO。S.glacialipiscicola作為優(yōu)勢(shì)腐敗菌只被發(fā)現(xiàn)于大黃魚(yú)中[18]，考慮到大黃魚(yú)和小黃魚(yú)的親緣關(guān)系和活動(dòng)范圍，這種菌株可能具有物種特異性和地區(qū)性。Carnobacterium maltaromaticum分布范圍僅次于S.glacialipiscicola，除HA外，其他條件下均被檢測(cè)到。該腐敗菌屬兼性厭氧型，在多種食品中均被發(fā)現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)腐敗菌，如雞肉、三文魚(yú)、南美對(duì)蝦等[19-21]，其在無(wú)氧條件下致腐能力較強(qiáng)，而在有氧條件下，其代謝活動(dòng)較弱[22]，因此真空包裝和氣調(diào)包裝下該腐敗菌所占比例要遠(yuǎn)高于空氣包裝。

空氣包裝下的變形桿菌屬是另一種常見(jiàn)的腐敗菌株，會(huì)對(duì)人體造成不適。Proteus Hauseri只作為生牛肉的SSO被報(bào)道[23]，因此推測(cè)該種菌以人體為媒介在捕撈和運(yùn)輸過(guò)程中污染小黃魚(yú)，該菌在CA下和高通量測(cè)序法下能被檢測(cè)到，但在空氣包裝下所占比例要高于其它包裝，推測(cè)其在厭氧條件下活動(dòng)能力不強(qiáng)，加上培養(yǎng)基的過(guò)濾使其未在CV和CM下被檢測(cè)到。Providencia heimbachae至今沒(méi)有在魚(yú)類(lèi)中作為優(yōu)勢(shì)腐敗菌被發(fā)現(xiàn)，但在人體排泄物中有報(bào)道[24]，因此這種腐敗菌污染途徑可能與P.Hauseri類(lèi)似。Planococcus migula只在HA下被發(fā)現(xiàn)，且占比達(dá)29.8%，該菌種廣泛分布于海洋，但至今未有文獻(xiàn)報(bào)道其為優(yōu)勢(shì)腐敗菌，該腐敗菌需在一定的鹽濃度下生長(zhǎng)，推測(cè)培養(yǎng)基的鹽濃度未達(dá)到其要求而無(wú)法培養(yǎng)，有待進(jìn)一步研究論證。

真空包裝下的Aeromonas salmonicida是另一種普遍的厭氧腐敗菌，其在HV條件下所占比例遠(yuǎn)大于CV，但其競(jìng)爭(zhēng)能力較弱故作為SSO存在的時(shí)間較短[14，25]，因此在氣調(diào)包裝的第10天已經(jīng)被其他微生物所競(jìng)爭(zhēng)淘汰而未能檢測(cè)到。

氣調(diào)包裝下的兩種檢測(cè)方法間的差異性最小，C.maltaromaticum和S.glacialipiscicola兩者之和占80%以上。Bacillus Cohn只在HM條件下檢測(cè)到，該菌屬在許多種類(lèi)的食品中都有發(fā)現(xiàn)，特別是面團(tuán)、面包、雞蛋等[26-27]，但鮮有作為水產(chǎn)品SSOs而被報(bào)道，張?chǎng)┑劝l(fā)現(xiàn)某些芽孢桿菌對(duì)大黃魚(yú)SSOs有一定的拮抗作用[28]。

培養(yǎng)基分離法檢測(cè)到的一些占比較低的腐敗菌在高通量測(cè)序下占比例均小于1%，而高通量測(cè)序法下一些腐敗菌并未由培養(yǎng)基分離得到，可能的原因是該腐敗菌無(wú)法在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，有待進(jìn)一步研究。由于這些腐敗菌占比較低故不考慮其為冷藏小黃魚(yú)的SSOs。

3 結(jié)論

包裝方式影響小黃魚(yú)的腐敗菌種類(lèi)，進(jìn)而影響代謝，導(dǎo)致貨架期的不同。檢測(cè)方法影響SSOs種類(lèi)和比例，主要原因是高通量測(cè)序法可以檢測(cè)不可培養(yǎng)微生物，總體而言高通量測(cè)序法在檢測(cè)腐敗菌組成上的準(zhǔn)確性要高于培養(yǎng)基分離法。如何減緩腐敗速率是未來(lái)水產(chǎn)保鮮的重點(diǎn)研究方向之一，獲得小黃魚(yú)SSOs種類(lèi)為后期針對(duì)性研究抑菌劑，如殼聚糖、Nisin及其衍生物等，提供了重要的理論基礎(chǔ)。

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