腌臘肉中優良乳酸菌的篩選鑒定及初步應用

胡美忠，郁建生，*，郁建平

（1.銅仁職業技術學院，貴州銅仁554300；2.貴州梵凈山農業高科技股份有限公司，貴州銅仁554300；3.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

發酵肉指原料肉中人工加入有益微生物或者利 用自然存在的有益微生物發酵，在有益微生物的作用下發生復雜的物理化學變化，使肉呈現出獨特風味的一類肉制品[1-2]，如火腿，香腸、酸魚、酸肉等肉制品。這些肉制品營養豐富、風味獨特、保質期長，是風靡全球的一類肉制品，深受廣大消費者的歡迎。

發酵肉中的微生物種類有乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌和霉菌[3]，大部分乳酸菌是一類公認安全的微生物（generally recognized as safe，GRAS），通常認為乳酸菌具有有助消化、產生人體所需的微生物和生長因子、維持腸道健康、增強免疫等益生性。人類利用乳酸菌來生產發酵食品的歷史已經有數千年，如奶酪、酸奶、酸肉、酸菜等，乳酸菌是發酵肉的常見菌種，在發酵肉中乳酸菌能防止發酵肉在發酵成熟過程中病原腐敗菌的侵襲、有利于提升發酵肉質地等功效[4-6]。篩選肉制品發酵劑菌株，乳酸菌菌種是一個重要的內容，許多乳酸菌優良菌株從發酵肉中分離出來，如分離自腌肉的Enterococcus sp.18，分離自火腿的Leuconostoc sp.20[7]，分離自熏制鮭魚的 Lactobacillus sakei R1333[8]。本文探討了從腌臘肉分離純化鑒定具有優良發酵性能的乳酸菌，初步探討了乳酸菌發酵制作牛肉干的品質。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及培養基

貴州省銅仁市周邊不同農戶家采用傳統方式制備的腌臘肉，共采集5份。

MRS培養基、牛肉干蛋白胨培養基（Nutrient A－gar）、平板計數培養基（plate count agar，PCA）：北京奧博星。

1.1.2 主要儀器

ZHJH-C1214C垂直流超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；TU-1901可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DELTA 320 p H計：上海閔勝科技有限公司；BPH-9042恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；HVE-50全自動高壓滅菌鍋：華粵集團有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集

無菌樣品袋裝置腌制臘肉，標記編號，置于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 乳酸菌分離

采集的腌制臘肉樣品，無菌條件下切成碎片，稱取25 g碎片加入225 mL無菌生理鹽水，震蕩5 min，吸取100 μL樣品液涂布于添加了1%碳酸鈣的MRS培養基，37℃下培養2 d～3 d，隨機挑取形態、大小不一致，有溶鈣圈的菌落重新劃線培養，重復1次～2次得到純培養菌落，做革蘭氏染色和過氧化氫酶測試，選擇革蘭氏陽性、過氧化氫酶陽性菌株，采用甘油保藏法置于-70℃冰箱保藏待用（取1 mL純培養菌液與1 mL 40%～50%甘油均勻混合于2 mL無菌螺紋管中）。

1.2.3 乳酸菌發酵性能篩選

1.2.3.1 24 h產酸能力測試

篩選得到的乳酸菌菌株活化，得種子液，種子液按1%比例接種于100 mL MRS培養基，37℃靜置培養24 h后測定各菌株菌液的pH值（重復3次，取平均值）。

1.2.3.2 15℃下生長能力測試

篩選得到的乳酸菌菌株活化，得種子液，種子液按1%比例接種于100 mL MRS培養基，15℃靜置培養48 h后，以空白MRS培養基為對照，測定各菌株菌液的OD600（重復3次，取平均值）。

1.2.3.3 6.5%氯化鈉耐受能力測試

篩選得到的乳酸菌菌株活化，得種子液，種子液按1%比例接種于100 mL添加了6.5%氯化鈉的MRS培養基，37℃靜置培養24 h后，以空白MRS培養基為對照，測定各菌株菌液的OD600（重復3次，取平均值）。

1.2.3.4 150 mg/L亞硝酸鈉耐受能力測試

篩選得到的乳酸菌菌株活化，得種子液，種子液按1%比例接種于100 mL添加了150 mg/L亞硝酸鈉的MRS培養基，37℃靜置培養24 h后，以空白MRS培養基為對照，分別測定各菌株菌液的OD600（重復3次，取平均值）。

1.2.3.5 發酵葡萄糖產氣能力測試

含0.8%瓊脂的MRS培養基，裝入無菌試管，用對數期的菌種穿刺接種，再在上傾倒2 cm 2%瓊脂封住，37℃培養48 h，觀察產生氣泡情況（試管內出現氣泡或者頂起2%的瓊脂，說明產氣）。

1.2.3.6 產黏液能力測試

篩選得到的乳酸菌菌株劃線培養于MRS培養基，37℃靜置培養48 h后，用接種環挑取菌落觀察是否出現黏液。

1.2.3.7 產蛋白酶能力測試

蛋白酶活性測定方法使用瓊脂板法[9]。篩選得到的乳酸菌菌株劃線培養于MRS培養基，37℃靜置培養48 h活化，活化的菌落轉接種于含有10%脫脂牛奶的MRS培養基，37℃靜置培養72 h后觀察菌落周圍是否出現蛋白水解圈。

1.2.3.8 產脂肪酶能力測試

篩選得到的乳酸菌菌株劃線培養于MRS培養基，37℃靜置培養48 h活化，活化的菌落轉接種于含有1%三丁酸甘油酯的MRS培養基，37℃靜置培養72 h后觀察菌落周圍是否出現脂肪水解圈。

1.2.4 乳酸菌產廣譜抑菌能力細菌素的篩選

篩選得到的乳酸菌菌株活化后接種于MRS培養基，37℃下靜置培養10 h得種子液，種子液按1%比例接種于100 mL MRS培養基，37℃下靜置培養24 h后，菌液6 000 g離心10 min，得上清液，以金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）和大腸桿菌（ATCC 25922）為指示菌，采用瓊脂擴散法測試上清液抑菌活性[10]。具體做法為：指示菌使用NA培養基活化，制備出OD≈1的指示菌菌液，NA固體培養基融化待其溫度降至40℃左右后（手持裝置NA培養基的瓶子不燙手），按1%比例加入指示菌菌液，混勻，倒平板，待平板凝固，上面放置牛津杯或者打孔器打孔，孔中加入60 μL乳酸菌發酵上清液，37℃下靜置培養18 h～24 h，測量抑菌圈直徑。檢測乳酸菌是否產生廣譜抗菌作用細菌素方法流程為：100 mL乳酸菌發酵上清液，凍干，用20 mL無菌水溶解后分成3份樣品，樣品1用3 mol/L氫氧化鈉和乳酸調節pH值至5.5，樣品2加入0.5 mL過氧化氫酶（2.5 kU/mL～5 kU/mL）后37℃水浴2 h，樣品3作為對照，以金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）和細菌大腸桿菌（ATCC 25922）為指示菌，采用瓊脂擴散法測試3份樣品的抑菌活性，以檢測是否發酵液中是否含有廣譜抗菌作用細菌素。

1.2.5 乳酸菌的種屬鑒定

1.2.5.1 生理生化鑒定

經過篩選，得到1株具有應用于肉制品發酵潛力的菌株，編號為R3-1。根據《伯杰氏系統細菌學手冊》[11]和凌代文的《乳酸菌細菌分類鑒定及實驗方法》，對R3-1進行生理生化鑒定。

菌株R3-1菌株劃線接種于MRS培養基，37℃培養48 h，觀察菌落形態、顏色和表面光滑等。菌株R3-1 MRS培養基活化至OD600≈1，取100 μ菌液，加入乳酸菌生化鑒定管（海博，青島，中國）中，37℃靜置培養24 h～48 h觀察結果。

1.2.5.2 分子生物學鑒定

菌株R3-1總DNA提取，16S rDNA擴增和測序由金唯智生物科技有限公司完成，測序所得的16S rDNA序列校對后，與NCBI的 GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）數據庫或者 http：//www.ezbiocloud.net進行BLAST分析，根據序列同源性，確定菌株的種屬關系確定菌株的種屬關系。

1.2.6 植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2關系考察

在從銅仁腌臘肉尋找肉品發酵劑菌株的過程中，除了篩選到優良的植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1外，還得到一株具有優良發酵性能木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2（數據未列出），兩者有可能組成復合肉品發酵劑。在研究的過程中同時發現植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1產廣譜抑菌作用的細菌素，故考察植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1是否對木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2有拮抗作用是兩者是否能成為復合肉品發酵劑的關鍵。試驗植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2關系采用十字交叉法，植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1在PCA培養基上劃直線培養，同時，木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2劃直線培養并與植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1線交叉形成十字交叉，37℃培養36 h后觀察交叉處是否出現拮抗作用。

1.2.7 復合發酵劑發酵牛肉干初步研究

植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1和木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2培養后，4℃下6 000 g離心5 min，收集菌體，適量無菌生理鹽水懸浮（OD600≈1）。選擇上好牛肉切片，煮熟瀝干后，1%葡萄糖，5%氯化鈉，2%蔗糖和0.1‰硝酸鈉腌制4℃牛肉片24 h，植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1和木糖葡萄球菌（s.xylosus）P2按體積比1∶1比例混合制作混合發酵劑（109cfu/mL），按牛肉重量10%比例接種復合發酵劑，15℃下發酵120 h后，按1%醬油，1.5%胡椒粉，1%鮮姜，0.01%白胡椒粉，0.05%料酒加入發酵好的牛肉，攪拌均勻后風干（或60℃～70℃烘干），得發酵牛肉干成品。以不加菌和只加乳酸菌同樣制作的牛肉干為對照，發酵牛肉干成品請15位人員品嘗，采用9分制從顏色、風味、質地、味道和總體接受度打分，比較復合發酵劑的優劣。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從貴州銅仁采集的5份腌臘肉樣品中，共得到26株革蘭氏陽性、過氧化酶陰性的乳酸菌菌株。MRS培養基是一種半選擇性培養基，可以用來選擇性分離乳酸菌。經過MRS篩選得到的菌株，再經過革蘭染色和過氧化氫酶鑒定，基本上可以假定為乳酸菌（乳酸菌是革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性菌）。

乳酸菌在發酵食品如酸菜、奶酪等發酵食品中豐度很高，不同發酵食品其生境不一樣，從而不同的發酵食品所含有的乳酸菌種類及生化性質不同。工業用乳酸菌菌種，為了使其適應工業生產的目標發酵環境，從相應的發酵產品中分離篩選是捷徑。故分離篩選用作發酵肉制品發酵劑的乳酸菌菌株，其分離第一來源應是發酵肉制品，比如腌肉、火腿、香腸等。

2.2 乳酸菌的發酵性能篩選

2.2.1 24 h產酸能力測定結果

乳酸菌在24 h產酸能力是衡量乳酸菌菌株品質優劣的一個重要指標，產酸能力越強，說明菌株性能越佳。分離得到的26株乳酸菌菌株產酸能力見圖1。

圖1 乳酸菌MRS培養基中24 h產酸能力Fig.1 Acid-producing ability of LAB incubated in MRS broth after 24 h

由圖1可知，分別用MRS培養基培養24 h后，絕大部分菌株的產酸能力都強，61.5%的菌株能夠使培養基的pH值從6.2下降到3.8甚至更低，少部分菌種的培養基pH值從6.2下降至4.1左右，也有3株乳酸菌菌株產酸能力較弱，其培養基的pH值從6.2下降到4.5左右。

2.2.2 15℃生長能力、耐鹽能力及耐亞硝酸鈉能力測試結果

分離的乳酸菌15℃生長能力、耐鹽能力及耐亞硝酸鈉能力見圖2。

圖2 乳酸菌15℃生長能力、耐氯化鈉能力及耐亞硝酸鈉能力Fig.2 Tolerance to sodium chloride，sodium nitrite and growth conditions at 15℃of LAB

由圖2可知，菌株R3-1、R1-1等9株菌在15℃下生長良好，37℃培養48 h后，培養基OD600值超過1，占比42.3%。在6.5%氯化鈉耐受試驗中，46.2%的乳酸菌菌株在6.5%氯化鈉條件下生長良好，37℃培養24 h，培養基OD600可達到1.5甚至更高，其余乳酸菌菌株的生長則受到氯化鈉不同抑制。耐亞硝酸鈉試驗中，只有菌株R1-5顯示不耐受150 mg/L的亞硝酸鈉，其他乳酸菌菌株在此濃度的亞硝酸鈉下均能良好生長。

2.2.3 產黏液、發酵葡萄糖產氣、蛋白酶活性及脂肪酶活性結果

產黏液、發酵葡萄糖產氣、蛋白酶活性及脂肪酶活性結果見表1。

由表1可知，菌株R3、R23、R12產生黏液，占比為11.3%，發酵葡萄糖產氣試驗表明菌株R3-2、R4-5、R4-1、R2-6能夠發酵葡萄糖產氣，占比為15.4%。菌株 R3-1、R1-1、R3、R2-6、R2-表現出蛋白酶活性，占比為19.2%。脂肪酶測試則表明這26株菌均無脂肪酶活性。

在發酵食品中，產酸量對于控制病原性腐敗菌和發酵食品口味至關重要[12]，但不同種屬的乳酸菌產酸能力不同，為了篩選得到產酸能力強的乳酸菌菌株用作發酵劑，24 h產酸能力是一個重要指標，通常用培養基pH降低程度來衡量。

發酵肉發酵成熟時，其環境對細菌來說不友善，通常處于15℃低溫，這個溫度很多細菌不能生長或者生長緩慢，這些比較極端的環境會抑制大部分細菌的生長繁殖，而作為肉制品工業用發酵劑的菌株則需要在這種環境下迅速生長繁殖，故尋找肉制品乳酸菌發酵劑菌株，需要篩選其對極端環境的耐受能力[13]。

乳酸菌有兩種代謝類型，同型發酵和異型發酵。乳酸菌通過同型發酵可以把1分子葡萄糖全部轉變為2分子乳酸，如果通過異型發酵，葡萄糖不會全部被轉換為乳酸，還會被轉換成醋酸、CO2等其他物質。異型發酵會產生氣體，會破壞產品質地對產品不利[14]，故作為乳酸菌發酵劑菌株，要求其代謝途徑為同型發酵，不能發酵葡萄糖產氣。

部分乳酸菌代謝過程中會產生黏液，而黏液對肉制品來說會危害質地、顏色甚至口味，對于乳酸菌發酵劑菌株來說，代謝過程不能產生黏液[14]。

少部分乳酸菌能產生蛋白酶，絕大多數乳酸菌沒有脂肪酶活性[15]。發酵肉中，乳酸菌的主要貢獻是產生有機酸來增加肉制品安全和質地，對于發酵肉風味的貢獻幾乎可忽略不計。故乳酸菌的蛋白酶和脂肪酶活性不是篩選乳酸菌肉制品發酵劑的重要指標。

表1 乳酸菌發酵特性Table 1 The fermentation property of LAB

2.3 乳酸菌產廣譜抑菌能力細菌素的篩選

乳酸菌作為肉制品發酵劑菌株，乳酸菌主要起到降低pH值，抑制病原微生物的作用，故其培養液的廣譜抑菌能力對于乳酸菌發酵劑來說很重要。乳酸菌產生的抑菌物質有很多，比如說有機酸、過氧化氫、細菌素等[7，16]。故測試乳酸菌的抑菌活性及是否產生廣譜抗菌作用細菌素對乳酸菌發酵劑來說具有很高的價值。試驗結果見表1，由表1可知，在篩選得到的26株乳酸菌中，菌株 R1-5、R2-3、R2-6、R5-1、R4-2 的發酵液對指示菌沒有抑制活性，占比為19.2%，其他菌株表現對指示菌不同的抑菌活性。在排除酸抑制、過氧化氫抑制后，只有菌株 R3-1、R1-1、R3-9、R23 表現出產廣譜抑菌作用的細菌素，其他則無。

細菌素是由細菌核糖體代謝產生的一種多肽物質，一般來說，對親緣關系近的菌有抑制作用，但是也有少部分細菌素具有廣譜抑菌作用[17-18]。大部分乳酸菌能產生細菌素，少部分乳酸菌能產生具有廣譜抑菌作用的細菌素，這部分乳酸菌及其產生的細菌素在發酵食品的防腐中具有重要的作用，能在很大程度上延長食品的貨架期，而且細菌素來源于乳酸菌，大部分乳酸菌是公認安全的菌，來源安全。故乳酸菌發酵劑菌株，能產生廣譜抗菌作用細菌素的菌株是最佳的，能夠延長貨架期。

2.4 植物乳桿菌R3-1種屬鑒定

2.4.1 生理生化鑒定

菌株R3-1 MRS培養基上為乳白色菌落，培養72 h菌落直徑3 mm左右，表面光滑，革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性。

乳酸菌生化鑒定試劑盒表明，菌株R3-1能利用纖維二糖、七葉苷、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨糖醇、蔗糖、棉子糖、菊粉、乳糖和1%馬尿酸。對照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[19]，顯示菌株R3-1最可能為植物乳桿菌。

2.4.2 分子生物學鑒定

通過細菌基因組提取試劑盒提取菌株R3-1、R1-1總DNA。利用16s rDNA通用引物進行PCR擴增，得到約1.5 kb的PCR擴增產物，由北京金唯智生物科技有限公司測序，測得所得到的16S rDNA基因序列，在www.ncbi.nlm.nlh.gov網站中使用BLAST在基因庫中進行同源性搜索，所得結果中表明菌株R3-1與植物乳桿菌Lactobacillus plantarum strain TMW 1.1623（complete genome） （accession number：CP017379.1），Lactobacillus plantarum strain LP2（complete genome）（accession number： CP020816.1），Lactobacillus plantarum strain CLP0611 （complete genome）（accession number：CP019722.1）相似度100%，結合生理生化試驗以及16S rDNA同源性比較結果，鑒定R3-1植物乳桿菌（Lb.Plantarum）。

2.5 植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2 關系

十字交叉法試驗證明在交叉處植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2的菌落線生長正常，沒有出現抑制現象，各自菌落線與非交叉處沒有區別，表明植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2之間不存在拮抗作用，二者可以作為復合發酵劑用作肉品發酵。

在發酵肉制品生產過程中，植物乳桿菌通常和木糖葡萄球菌聯合使用[20]，然而，在研究中發現植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1能產生抑制金黃色葡萄球菌（革蘭陽性代表）和大腸桿菌（革蘭陰性代表）的細菌素，所以植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1是否對木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2有拮抗作用是兩者能否作為復合發酵劑的關鍵。試驗證明兩者可以作為復合發酵劑，可能是因為植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2都分離自同來源的傳統腌臘肉，它們之間已經相互適應，可以作為復合發酵劑菌種。

2.6 復合發酵劑發酵牛肉干初步研究

發酵牛肉干試驗結果顯示，植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2按照體積比1∶1比例組成的復合發酵劑，在牛肉干成品顏色、氣味，質地，口味和總體接受度方面比單獨使用植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1或者不使用發酵劑有顯著改善（p＜0.05）見表 2。

表2 發酵牛肉干評估Table 2 Sensory evaluation of beef jerky

在發酵肉制品中，乳酸菌的主要貢獻為降低pH值，抑制病原腐敗菌，改善產品質地延長貨架期，而凝固酶陰性的葡萄球菌主要貢獻為風味和成品顏色[21]。他們通常組成復合發酵劑在肉制品發酵生產中使用，試驗植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1與木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2表明兩者聯合使用是一種優秀的復合發酵劑，具有應用于肉品發酵的潛力。

3 結論

從5份腌臘肉中分離得到26株乳酸菌，經過發酵性能篩選，得到一株發酵性能優良，具有應用于肉品乳酸菌發酵劑菌株R3-1，經過生理生化和16S rDNA鑒定為植物乳桿菌（Lb.Plantarum）。植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1產酸能力強，耐低溫、耐高鹽、耐高濃度亞硝酸鹽、不產氣不產黏液，產廣譜抑菌作用細菌素，且對同分離來源的木糖葡萄球菌（S.xylosus）P2沒有拮抗作用，兩者聯合發酵牛肉干試驗表明，相對于單獨使用植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1發酵劑或者不使用發酵劑，兩者復合的發酵劑制作的牛肉干成品，在顏色、氣味、質地、口感和總體接受度上都有顯著改善，表明植物乳桿菌（Lb.Plantarum）R3-1有作為肉制品乳酸菌發酵劑菌株的潛力。

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