串聯質譜法測定小白杏中農藥殘留

李俊芳，景偉文，加列西·馬那甫

（新疆農業大學化學工程學院，新疆烏魯木齊 830052）

輪臺小白杏是全球少有的特種優質杏果，俗稱珍珠玫瑰杏，是杏中奇珍。新疆小白杏病蟲、樹體病害較為嚴重，南疆杏樹主栽區樹體蟲害主要有蚧殼蟲、春尺蠖、蚜蟲和棕尾蛾等，科學預防杏樹蟲害、病害能力不足[1]。由于缺乏科學施藥的指導，導致個別果農超標超量使用農藥，為防止少量農藥污染的小白杏流入市場，需建立準確高效的分析鑒定方法進行監測。小白杏是新疆特產之一，由于氣候環境的影響在種植過程中所使用的農藥類型與其他地區及國家的是不同的，因此本文擬建立更具有針對性和區域適用性的方法，此方法不僅可以應用于對外貿易檢測，也可以為新疆地方標準的建立提供實驗依據。

近年來，新技術、新方法的出現，對食品安全的分析起到了重要的促進作用。農藥殘留的檢測雖有國家標準方法，國標方法中的檢測儀器較為普遍，而大多數實驗室所有的儀器并非與之一致，因此必須重新摸方法、優化條件；大多數的國家標準或行業標準僅針對同一類型或兩個類型的多個農藥進行檢測，而對于不同類型多種農藥的檢測鮮見發布。本文擬建立適用于多種類型的多個農藥的檢測方法。

在眾多方法中，液相色譜的應用范圍較氣相色譜的應用范圍寬。超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UHPLC）[2-3]與傳統的高效液相色譜（high efficiency liquid chromatography，HPLC）相比，分析速度和分離效果都略勝一籌。HPLC與多級質譜（multi-stage mass spectrometry，MSn）的聯用技術已廣泛應用于食品安全領域[4-7]。采用UHPLC-MS/MS技術進行農藥多殘留成分的快速分析時，子離子或碎片離子提供的結構信息是定性和定量的重要依據。

Q Exactive將四級桿和Orbitrap高分辨技術結合起來，具有選擇性好、靈敏度高、檢出限低及樣品無需衍生化等特點，在現有的農藥殘留檢測技術中優勢顯著[8-16]。但在采用液相色譜串聯質譜檢測不同類型的農藥時，某幾種農藥的碎片離子無法獲得或碎片離子產率較低[17-21]，從而影響該方法的選擇性和靈敏度。因此獲取多種類型農藥的碎片離子是進行液相色譜串聯質譜分析的前提。通過優化相對碰撞能量（Normalized collisionenergy，NCE）可以有效提高碎片離子的產率[22]。不同物質的碰撞能量往往不同，通常由NCE（%）表示。NCE（0%～100%）與共振激發電壓（0～2.5 V）有關，母離子的質荷比大小決定著NCE的大小。增大NCE可增強共振激發電壓，提高母離子的平動動能，增加母離子與阱中阻尼氣體（氮氣）的碰撞次數，從而提高母離子內能及產生碎片離子的產率[23]。

本文優化了時下最流行的快速樣品前處理技術（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe，QuECh－ERs）提取方法[24-25]、分散固相萃取法（disperse-solid phase extraction，d-SPE）凈化條件，并采用優化后的NCE能量對新疆小白杏中7種常見農藥多殘留量進行檢測，獲得了較好的分析結果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小白杏為新疆輪臺地產：北園春農貿批發市場。

吡蟲啉（純度＞97.5%）：Dr Ehrenstorfer GmbH公司；毒死蜱、氰戊菊酯、辛硫磷、嘧啶磷、氯氰菊酯、殺撲磷標準品（純度＞99%）：農業部環境保護科研監測所；甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）：色譜純，Fisher公司；甲酸（FA）、醋酸（HAc）：分析純，上海國藥集團；無水硫酸鎂、無水醋酸鈉、氯化鈉：均為分析純，上海國藥集團，用前在馬弗爐500℃灼燒4 h，冷卻后貯于干燥器中備用；N-丙基乙二胺（PSA）、C18封端的硅膠（C18E）：Agela博納艾杰爾科技；0.2 μm 有機相微孔濾膜：美國Thermo-Fisher公司；實驗用水：艾柯純水儀制備高純水。

1.2 儀器與設備

Q Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜系統：配有熱噴霧離子源HESI及Xcalibur 2.0數據處理系統、Dionex UltiMate 3000快速高效液相色譜系統：美國Thermo-Fisher公司；TD5A-WS離心機：上海湘儀離心機廠；HZQ-50H回旋振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 樣品前處理方法

稱取10.0 g試樣于50 mL具塞離心管中，加入10.0mL含1%乙酸的乙腈液，上下振蕩30min，加入1g醋酸鈉、4.00 g無水硫酸鎂，加入相應量的農藥標準品（空白不加標準品），手動上下振蕩1 min，4 200 r/min離心5 min，取1 mL上清液快速加入裝有0.15 g無水硫酸鎂和0.05 g PSA及0.05 g C18E的10 mL離心管中，快速手動振搖20次，4 200 r/min離心5 min，取上清液過0.2 μm有機微孔濾膜，裝入進樣小瓶中待LCMS/MS測試。

1.4 測試方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Thermo aQ C18柱（100 mm×2.1 mm，i.d.，2.6 μm）；流動相：5 mmol/L 醋酸銨水（A）和 0.1%乙酸乙腈（B），梯度洗脫見表1。流速0.2mL/min，柱溫20℃；進樣量 5 μL。

表1 流動相的梯度洗脫程序Table 1 Gradient program of mobile phase

1.4.2 質譜條件

Q Exactive質譜儀配備著HESI電噴霧離子源（正離子模式）；室內環境控制在溫度20℃、相對濕度40%；噴霧電壓：3.5 kV；HESI源溫度：300℃；離子源溫度：250 ℃；鞘氣：35 arb；輔助氣：10 arb；反吹氣：0 arb；S-lens RF電壓55 V；源內氮氣99%；高能碰撞池HCD及C-Trap中的緩沖氣均為高純氮99.99%；每3天校正一次質量軸；所有定量數據均由全掃描/target-MS2模式得到，該模式是由全掃描模式聯合vDIA碎裂方式，依據碎片離子能量進行dd-MS2的子離子掃描組成；全掃描質譜的分辨率在70，000FWHM；自動增益控制（automatic gain control，AGC）設為 1.0e6，最大離子進樣時間（injection time，IT）為 100 ms；掃描范圍m/z 50～500；默認相對碰撞能量（NCE）為35%。

2 結果與分析

2.1 正離子模式下裂解途徑

對7種農藥標準品同時進行正負離子掃描，結果發現正離子模式下的響應信號遠高于負離子模式下的響應信號，因此，本文的所有測試均選用正離子模式。

對小白杏中常用的7種農藥，在默認質譜條件下（NCE為60%）進行分別直接進樣測試，得到7張質譜圖，根據碎片峰，推測可能的碎片結構，并解出7種農藥的質譜裂解規律圖，如圖1～圖7所示。

由圖1～圖7可知，在較高的碰撞能量下，母離子得到了較多的子離子，有利于做定性分析。但是對于個別幾種化合物，碰撞能量為60%時，出現了超過5個碎片離子，說明該化合物的量被分散到了5個以上的離子當中，在定量分析中是不利的。選擇合適的能量，使化合物產生特征的2～3個碎片離子，可以得到更好的定性及定量結果。

圖1 吡蟲啉的質譜裂解圖Fig.1 Hypothetical fragmentation pattern of Imidacloprid

圖2 辛硫磷的質譜裂解圖Fig.2 Hypothetical fragmentation pattern of Phoxime

圖3 殺撲磷的質譜裂解圖Fig.3 Hypothetical fragmentation pattern of Methidathion

圖4 嘧啶磷的質譜裂解圖Fig.4 Hypothetical fragmentation pattern of Pirimiphos

圖5 毒死蜱的質譜裂解圖

圖7 氰戊菊酯的質譜裂解圖Fig.7 Hypothetical fragmentation pattern of Fenvalerate

2.2 質譜相對碰撞能量的優化

離子阱質譜可以儲存離子、進行多級掃描，具有快速和高靈敏度的優點，所以它可以提供分子組成和結構的豐富信息。離子阱質譜分析樣品時，通過調節相對碰撞能量（NCE），就可以增加碎片離子的種類[20-21]。其原理為：NCE與共振激發的電壓相關，增大NCE可增強共振激發電壓，提高母離子的平動動能，增加母離子與阱中阻尼氣體（高純氮氣）的碰撞次數，從而提高母離子內能及產生碎片離子的產率[22]。但，能量過高，產生過多不具特征性的子離子，不利于建立母離子-子離子的定量關系。所以選擇合適能量可有效提高定量離子的響應值，增加定量的靈敏度。

本試驗對7種農藥中特征的幾種碎片離子進行碰撞能量的優化，得到能量-響應圖見圖8所示，由該圖可以很明顯的觀察到響應值最高的碎片離子，即可作為定量離子：其次可以發現不同碎片離子的最佳碰撞能量，作為質譜測試的最佳碰撞能量條件。

由圖8可以看出m/z 256.10是吡蟲啉3種碎片離子中響應值最高的一個，因此在定量分析中，選用此離子為定量離子。當碰撞能量NCE為35%時，m/z 256.10的響應值最高，所以確定測試吡蟲啉的碰撞能量為35%。按照此方法得到辛硫磷、殺撲磷、嘧啶磷、毒死蜱、氯氰菊酯、氰戊菊酯農藥的最佳碰撞能量分別為：45%、45%、35%、35%、60%、60%。

圖8 吡蟲啉碎片離子的碰撞能量優化圖Fig.8 Fragment ions collision energy optimization diagram of Imidacloprid

2.3 質譜條件的選擇

由于Q Exactive質譜儀結合了四極桿質譜與Obitrap質譜各自的優點，具有高分辨率和高靈敏度的特點。與三重四極桿質譜定量手段不同，Q Exactive質譜在Full Scan/dd-MS2模式下應用vDIA碎裂模式，同時進行全掃描和全范圍+二級質譜掃描，具有更好的定性、定量準確度。在HESI+模式下，對7種農藥的質譜條件進行了優化，分別采用Full Scan和Full Scan結合dd-MS2的子離子掃描方式，優化得到了母離子、子離子及最佳碎裂能量，以響應值最大的子離子為定量離子，以相對豐度較高的兩個離子對為定性依據，增加了定性的準確度，從而得到了最優的質譜條件見表2。

表2 7種農藥的的質譜采集參數Table 2 MS Parameters for 7 pesticides

2.4 超高效液相色譜串聯軌道離子阱質譜條件的確定

采用優化后的色譜條件、質譜條件及優化后的碰撞能量，得出小白杏中7種常見農藥的總離子流圖及其各農藥的提取離子色譜圖，如圖9所示。7種農藥的提取離子色譜圖峰型較尖銳，幾乎無其他雜峰，說明此條件可用于實際樣品中該7種農藥的分析測試。

采用Q Exactive質譜儀在UPLC-HRMS/MS條件下，對基質共存的多種農藥進行分析，結果發現在純溶劑中樣品的離子峰強度或大于或小于在基質中樣品的離子峰強度，說明基質在一定程度上影響著農藥的電離。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性方程、相關系數

準確移取100 mg/L甲醇標準儲備液10、30、50、70、100 μL于10.0 mL容量瓶中，并用甲醇定容，得到一系列不同濃度的標準溶液。按已優化好的條件進行測定，分別以化合物離子峰面積y對濃度x擬合線性方程，相關系數r均大于0.9，各組分的線性方程、線性范圍、檢出限、定量限列于表3。

圖9 小白杏中7種農藥的提取離子色譜圖（基質加標量1 mg/kg）Fig.9 Extracted ion chromatogram of 7 pesticides（spiked in 1 mg/kg）

2.5.2 檢出限和定量限

以空白小白杏加標實驗（加標量0.1 mg/kg，取6各獨立樣品進行測試）在儀器上的響應為基礎，以3倍信噪比所對應的濃度為方法的檢出限，得出7種農藥的檢出限[LOD=3S/b（S峰面積的標準偏差，b為標準曲線的斜率）]；以10倍S/N所對應的濃度為方法的定量限[LOQ=10S×c/X（S峰面積的標準偏差，c加標濃度，為測定結果的平均值）]，相關結果見表3所示。

2.5.3 回收率和精密度

準確稱取10.000 g小白杏勻漿后樣品，按照1.3節方法進行處理，按照1.4節條件進行測試，測定7種農藥的含量，平行測定5次，計算平均含量及RSD，結果列于表3。

采用實際樣品添加標樣的方法測定回收率。去10.000 g小白杏勻漿后樣品，分別加入一定量的7種農藥標樣，按照1.3節和1.4節的方法進行處理和測試，并根據原含量、加標量測定量計算回收率和RSD，結果見表3。

表3 方法學驗證結果Table 3 Summary of validation results

2.6 實際樣品的定量效果驗證

為了考察方法的定量準確性，準確稱取10.0 g市售小白杏勻漿后樣品，按照1.3節方法進行處理，按照1.4節條件進行測試，測定7種農藥的含量，該方法對實際小白杏樣品（購自烏魯木齊市新北園春批發市場）進行了兩個加標濃度水平的測定見表4。

表4 實際小白杏樣品分析驗證結果總結Table 4 Summary of confirmatory results obtained by analysis of real apricot samples

由表4的驗證結果可知，通過對空白樣品和加標樣品的對比分析，可以得到良好的定量結果。

3 結論

本文建立了集QuEChERs提取方法、d-SPE凈化技術和超高效液相色譜串聯高分辨質譜的方法，通過優化相對碰撞能量，對新疆小白杏中的7種常見農藥進行了測試，結果表明，經過NCE優化后的質譜響應值要高于未優化的結果。考察了方法的線性范圍、線性方程、定量限、加標回收率及RSD，試驗結果表明，該方法具有較高的準確度和靈敏度，滿足新疆小白杏中農藥多殘留的檢測目的與要求，并為建立新疆地方標準提供試驗依據。

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