仙珍骨康膠囊對小鼠地塞米松骨質疏松模型關鍵療效指標的影響

劉 雙 潘桂海 史建強 周 飛 林加西 陽慧芝 吳志華 陳嶸祎

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫性疾病，目前仍然主要使用糖皮質激素(GC)治療。而約30% SLE患者因此誘發糖皮質激素性骨質疏松癥(Glucoeorticoid induced osteoporosis，GIOP)[1]。目前GIOP居繼發性骨質疏松病因的第一位，較原發性骨質疏松癥更易發生骨折或股骨頭缺血壞死，甚至殘疾[2]。本課題組既往采用仙珍骨康膠囊防治SLE患者GIOP取得確切的療效，證明了中醫補腎健脾法組方結合糖皮質激素治療SLE能產生良好的協同效應來防治GIOP[3]。然而SLE合并GIOP的病因較復雜，為避免因患者病情、病程、糖皮質激素劑量、遺傳背景等差異對藥物的療效造成統計學上的偏倚，為探討仙珍骨康膠囊防治GIOP的分子機制，本研究通過建立小鼠地塞米松骨質疏松模型，并對關鍵療效指標進行實時量效研究，以探討仙珍骨康膠囊防治糖皮質激素性骨質疏松癥的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與儀器 5周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠40只,體質量15～17 g,均由廣東省醫學實驗動物中心提供,喂食普通顆粒飼料,室溫20℃左右,自然光照,保持良好通風,自由進水進食。主要儀器:多模式活體成像系統(德國BRUKER，型號In-VivoXtreme),透射電鏡(日本JEM-1400型透射電子顯微鏡)。

1.2 主要藥物和試劑 地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業有限公司,國藥準字H12020515),仙珍骨康膠囊(由廣東醫科大學天然藥物開發公司提供,中國專利號:201410412279.4,批準文號:粵藥制字Z20070673)。仙珍骨康膠囊是由淫羊藿、蛇床子和珍珠層粉組成的中藥復方制劑。具有溫腎壯陽、強筋骨、袪風濕等功能，適用于陽萎遺精、筋骨痿軟、風濕痹痛、麻木拘攣、婦女宮冷、寒濕帶下和中老年人骨質疏松癥等。I型前膠原C-端肽(PICP) 、骨鈣素(BGP)、骨堿性磷酸酶(BALP)、雌二醇(E2)、降鈣素(CT)、甲狀旁腺激素(PTH)、孕酮(PRG)ELISA試劑盒(上海研輝生物科技有限公司), 血鈣、血磷測試盒(上海合雨生物科技有限公司), Trizol(life technologies)。

1.3 分組與造模方法 將40只C57BL/6小鼠按隨機分組設計原則，分為地塞米松組(A組)、仙珍骨康組(B組)、地塞米松+仙珍骨康組(C組)和對照組(D組)，每組10只。地塞米松組小鼠按1 mg/kg的劑量，每周2次臀肌注射地塞米松磷酸鈉；仙珍骨康組以仙珍骨康混懸液22 mL/kg灌胃，每日1次；地塞米松+仙珍骨康組小鼠按1 mg/kg的劑量，每周2次臀肌注射地塞米松磷酸鈉并以仙珍骨康混懸液22 mL/kg灌胃，每日1次；對照組正常飼養，不做處理。實驗6周后處死全部老鼠。

1.4 指標檢測

1.4.1 骨密度測定 處死前，給予小鼠腹腔注射10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，當小鼠呈穩定的昏睡狀態達到5 min以上時，利用多模式活體成像系統對脊柱及雙側股骨近端進行X線攝片，利用自帶軟件進行雙側股骨近端及L2骨密度測定。

1.4.2 透射電鏡觀察 取右側股骨的下1/3段，使用銳利器械從其冠狀面剖成兩半，3%的戊二醛固定24 h后，然后以5%的硝酸脫鈣1周，送交電鏡室行常規超薄切片、電鏡觀察。

1.4.3 血液學檢測 采用10%水合氯醛將小鼠麻醉后，采用摘除眼球的方法取血，提取血清后，置于-20℃冰箱內保存。按試劑盒說明書上的方法，分別測定血清甲狀旁腺激素(PTH)、I型前膠原C-端肽(PICP)、骨鈣素(BGP)、骨堿性磷酸酶(BALP)、雌二醇(E2)、孕酮(PRG)、降鈣素(CT)、血鈣、血磷的含量。

2 結果

2.1 各組小鼠骨密度測定結果 地塞米松組股骨近端及L2的骨密度最低(P<0.01)，仙珍骨康組、地塞米松+仙珍骨康組與對照組股骨近端骨密度的差異均無統計學意義(均P>0.05)，見圖1、表1。

2.2 透射電鏡觀察各組小鼠成骨細胞形態 地塞米松組見成骨細胞溶解，形態變長；仙珍骨康組見成骨細胞結構正常, 細胞核染色質分布均勻；地塞米松+仙珍骨康組見成骨細胞核為卵圓形，有膠原分泌；正常對照組成骨細胞可見有較多膠原分泌, 細胞中存在大量內質網及線粒體(圖2)。

2.3 各組小鼠各項血液指標的結果 仙珍骨康組PTH水平最高，地塞米松+仙珍骨康組次之，其次為對照組，地塞米松組最低(P<0.0001)；仙珍骨康組PICP、BALP水平最高，其次為地塞米松+仙珍骨康組與對照組，地塞米松組最低(P<0.0001)；地塞米松組BGP、E2水平最高，其次為地塞米松+仙珍骨康組和對照組，仙珍骨康組最低(P<0.0001)；仙珍骨康組PROG水平最低，其次為地塞米松+仙珍骨康組與對照組，地塞米松組最高(P<0.0001)；地塞米松組CT水平最高，對照組次之，其次為地塞米松+仙珍骨康組，仙珍骨康組最低(P<0.0001)；各組血鈣及Pi水平的差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

圖1 德國BRUKER多模式活體成像系統檢測各組小鼠股骨近端及L2的骨密度

圖2 透射電鏡觀察各組小鼠成骨細胞形態

表1 各組小鼠股骨近端及L2椎體骨密度比較

表2 各組小鼠觀察血液指標的檢測結果

3 討論

目前GIOP居繼發性骨質疏松病因的第一位，嚴重影響患者生活質量，增加家庭及社會的負擔，如何防治SLE合并GIOP已成臨床亟待解決的難題。采用仙珍骨康膠囊防治SLE患者GIOP的確切療效，不僅證明了復方中藥制劑可有效防治GIOP，而且在GIOP發病機制的研究上取得了可喜的進展[4,5]。本課題根據“腎主骨”的中醫學理論，腎虛是骨質疏松的發病關鍵，若腎精充足，則筋骨堅硬有力；腎虛則骨弱無力，故治療宜補腎壯骨；脾虛則后天化源不足，五臟失養，則導致腎精虧虛，骨骼失養，骨骼脆弱無力，最終致發生骨質疏松癥[6]。故宜用補腎壯骨、益氣健脾的治療法則[7，8]。本課題構建了糖皮質激素性骨質疏松動物模型從骨結構、動態、準確地觀測骨質疏松療效指標的變化，為仙珍骨康膠囊的應用提供更重要的實驗依據，并大力推動GIOP的機制研究[5]。

本研究發現地塞米松組股骨近端及L2的骨密度最低(P<0.01)，仙珍骨康組、地塞米松+仙珍骨康組與對照組股骨近端的骨密度的差異均無統計學意義(均P>0.05)，血清指標示血鈣與血磷濃度在各組中差異無統計學意義(P>0.05)，表明仙珍骨康膠囊可能不是從影響鈣、磷離子來起到防治骨質疏松的作用。但仙珍骨康膠囊能顯著升高小鼠血清中的PTH、PICP及BALP水平，下調BGP、E2、CT與PROG水平(P<0.01)。研究表明甲狀旁腺素類藥物比二磷酸鹽類藥物更能提高絕經婦女骨質疏松癥病人腰椎、股骨頸BMD，改善骨質量的療效肯定，且安全性較高[9]。此外，亦有研究表明甲狀旁腺素能有效改善糖皮質激素長期應用所造成的骨量丟失，增加骨密度，對預防糖皮質激素所導致的大鼠骨質疏松有顯著作用。甲狀旁腺素是判斷骨質疏松關鍵指標，仙珍骨康膠囊能顯著升高PTH水平表明該藥安全，高效，是SLE性糖皮質激素骨質疏松的良藥[5,7]。透射電鏡亦表明地塞米松組見成骨細胞溶解，形態變長；仙珍骨康組見成骨細胞結構正常, 細胞核染色質分布均勻；地塞米松+仙珍骨康組見成骨細胞核為卵圓形，有膠原分泌；對照組成骨細胞可見有較多膠原分泌, 細胞中存在大量內質網及線粒體[7,9]。

總之，上述研究活體成像、生化指標、電鏡結果進一步闡明了仙珍骨康膠囊防治骨質疏松的機制。表明仙珍骨康膠囊不但能顯著減低絕經前SLE患者服用糖皮質激素造成的骨質疏松或骨量減少，而且糖皮質激素耐受患者加服補骨膠囊后可以提高患者對糖皮質激素的敏感性。上述研究方法為中成藥防治GIOP的研究提供了新的思路及有效的實驗研究模型。為仙珍骨康膠囊的臨床應用提供了大量的實驗參考數據，為其分子機制的研究提供了依據。

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