菌酶協同發酵玉米副產品型飼料的參數優化研究

郭依萍， 曹國強 ， 任道平

（黑龍江金象生化有限責任公司，黑龍江 哈爾濱 150000）

玉米在淀粉的深加工過程中會產生30%左右的副產品，這些副產品中包括玉米皮、玉米蛋白粉、玉米漿等（耿春銀等，2005；蔣瑞芬，1994）。 玉米皮是副產品中含量最高的， 占比高達干基的10% ～14%，主要含量為蛋白質、纖維素、葡萄糖以及其他一些糖類（李鳳英，1995）。其中膳食纖維豐富，抗營養因子含量高，添加到飼料中不利于被動物吸收， 通常采取微生物發酵的方法將其轉化為有益的小分子物質（閆星月等，2022）。目前主要應用于發酵的菌種為乳酸菌、 酵母菌和芽孢桿菌三大類（李楊，2012）。乳酸菌可降低蛋白酶抑制劑的含量，降低蛋白質，釋放出游離的氨基酸（Lim等，2019）， 可提高多種氨基酸的含量 （Zhao 等，2017）， 減少副產品中的質酸含量 （Licandro 等，2019）和非淀粉多糖含量（Feng 等，2020）。 酵母菌可以使副產品半纖維素含量有效減少（Decimo等，2017）， 總酚的含量增加并促進異黃酮的生物轉化（Santos 等，2018）。芽孢桿菌可使副產品中蛋白酶抑制劑的含量降低70.3%（Yang 等，2019）。酶制劑發酵可以降解玉米副產品中的脂肪酸、纖維素及碳水化合物， 使副產品中的抗營養因子含量降低，還會增加維生素含量（聶利波等，2018）。本試驗研究復合菌種協同酶制劑發酵副產品時的優良菌種與合適的酶制劑及發酵條件， 以期優化菌酶協同發酵玉米副產物的工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗所用的玉米副產品飼料作為發酵底物， 由北安象嶼金谷生化科技有限公司提供。 植物乳桿菌、干酪乳桿菌、糞腸球菌、釀酒酵母，含量100 億CFU/g。 纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶，含量20000 U/g。 試驗所用的菌劑和酶制劑均購自昕大洋內丘生物科技有限公司。MRS 培養基、YPD 培養基培養等試驗試劑購自北京挑戰集團。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌和酵母菌的篩選 將菌株分別接種于培養基中培養， 平板計數活菌數達到1×108CFU/mL，獲得種子液。 將菌株按照不同比例混合后以10%（V/m）的比例接種到發酵底物上，料水比為1∶1（m/V），30 ℃發酵5 d。 測量pH 和還原糖含量。

1.2.2 酶制劑的篩選 將1.2.1 得到的最佳菌種混合比例按照10%（V/m）比例接種到發酵底物上，料水比為1∶1（m/V），30 ℃發酵5 d，添加酶制劑的總量150 U/g，分別進行單酶和混合酶發酵試驗。

將1.2.1 得到的最佳菌種混合比例按照10%（V/m）比例接種到發酵底物上，料水比為1∶1（m/V），30 ℃發酵5 d，將酶制劑按照確定的比例混合，設置酶制劑添加量梯度為0、50、100、150、200、300 U/g進行發酵試驗，確定酶制劑最佳添加量。

1.2.3 正交試驗確定最佳發酵條件 菌酶混合比例發酵底物，選取A 發酵溫度，B 料水比，C 接菌量三個因素設計3 因素3 水平正交試驗 （表1），發酵后取樣用仿生消化儀檢測物質消化率，對結果進行分析得出最適合玉米副產品的發酵條件。

表1 正交試驗因素水平

1.2.4 菌酶協同發酵處理玉米副產品底物 將菌劑和酶制劑按照上述得出的最佳比例混合，按1.2.3 中的得到的最佳發酵條件進行發酵，取樣用凱氏定氮法檢測粗蛋白質 （CP） 含量， 按照GB 2906-82 標準測定飼料中的粗脂肪（EE）含量，按照GB/T 6434-2006 標準測定粗纖維（CF）含量。

1.2.5 還原糖的測定 在試管內按表2 所示依次加入試劑，在540 nm 波長處用分光光度計檢測，以葡萄糖含量為X軸吸光度為Y軸，繪制葡萄糖標準曲線， 回歸方程為Y=0.7868X-0.0073，R2為0.9993。

表2 葡萄糖標準曲線制作

1.3 數據統計與分析 設置重復試驗組，用SPSS 23.0 軟件進行數據的分析處理，單因素試驗用單因素ANOVA 檢測，結果用“均值±標準差”表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選 試驗微生物發酵對還原糖含量和pH 變化的影響，7# 試驗組pH 和還原糖含量變化顯著優于對照組及其他試驗組（P＜0.05），還原糖含量37.4 mg/g，與1# 對照組20.3 mg/g 相比大幅提升（表3）。 選定釀酒酵母：植物乳桿菌比例為1∶1 為最佳菌種發酵組。

表3 不同比例菌劑發酵對還原糖含量及pH 的影響

2.2 酶制劑篩選

2.2.1 試驗添加酶制劑對玉米副產品型飼料的發酵影響 添加酶制劑后還原糖含量明顯增多，pH降低（表4），結果表明纖維素酶：葡聚糖酶=1∶1 為最佳酶制劑添加比例，此時還原糖含量40.8 mg/g顯著高于其他試驗組及對照組，pH 4.10 顯著低于其他試驗組（P＜0.05）。

表4 添加單酶和混合酶對還原糖含量及pH 的影響

2.2.2 試驗酶制劑最佳添加總量 當酶制劑總量增大時還原糖的含量也隨著增加，pH 隨著減小（表5）， 當添加量達到200 U/g 時還原糖含量和pH 較其他試驗組有顯著變化（P＜0.05），當添加量到300 U/g 時，與200 U/g 的試驗數據差距不顯著（P＞0.05），考慮成本因素，得出酶制劑的最佳添加總量為200 U/g。

表5 酶制劑添加總量對還原糖含量及pH 的影響

2.3 菌酶協同發酵試驗

2.3.1 發酵條件篩選試驗 三個因素對玉米副產品發酵還原糖含量的影響強弱為接菌量、料水比、發酵溫度（表6）。A2B2C3為最佳方案，還原糖含量達到45.6 mg/g，即發酵溫度30 ℃，料水比1∶1.2（g/mL），接菌量12%。由方差分析結果可知（表7），三個因素中發酵溫度和接菌量對還原糖含量影響顯著（P＜0.05），料水比影響不顯著（P＞0.05）。

表6 正交試驗結果

表7 方差分析結果%

2.3.2 試驗菌酶協同發酵玉米副產物后營養成分變化 試驗組的CP 含量提升26.6%，EE 含量提升30.8%，CF 含量減少25.4%， 均產生顯著變化（P＜0.05，表8），說明該發酵工藝可使玉米副產品型飼料的營養物質含量大幅提升。

表8 玉米副產品飼料發酵營養成分變化結果%

3 討論

不同微生物在發酵過程中會產生不同的代謝產物， 故在多菌發酵時這些代謝物相互之間會產生拮抗作用（劉玉輝等，2020），所以應根據不同的發酵底物來選擇合適的發酵菌種。 本研究選擇了飼料可添加菌種進行試驗， 乳酸菌代謝的酸性物質使環境pH 降低， 可有效抑制其他有害細菌的生長（Gareau 等，2010），且乳酸菌的抑菌性會隨著pH 的降低而逐漸減弱 （張開屏等，2020；Gareau 等，2010），故可通過產酸能力選擇優良乳酸菌。 釀酒酵母的粗蛋白質含量高達50%以上，應用其發酵玉米秸稈時可使粗蛋白質含量增加（惠文森等，2011）。玉米副產品飼料的營養物質含量較少，添加酵母菌可以改善飼料營養物質含量。家畜的胃腸道中含有強酸和高膽鹽， 所以篩選出耐受性強、高生存率的菌種尤為重要。

玉米副產品中含有很多纖維素無法直接被動物吸收，降解會產生還原糖，供微生物生長利用，從而導致pH 降低（冉杰，2014）。 pH 下降同時還原糖含量升高， 說明微生物發酵時纖維素得到有效降解。 本研究以pH 和還原糖含量為參考確定混合菌種發酵的最佳比例，當釀酒酵母：植物乳桿菌比例為1∶1 時發酵效果最好。

在微生物的發酵基礎上添加外源酶制劑對飼料進行預處理，成本低、操作簡單且易于控制，酶水解的代謝產物可以促進微生物生長， 對菌種的發酵有促進效果（Liu 等，2016）。 纖維素酶可以對植物細胞壁進行水解， 為飼料提供糖分和其他養分，也可有效降低NDF 的含量（楊志剛等，2002）。木聚糖酶可以有效增加飼料的物質轉化率（汪儆等，1997）。 葡聚糖酶的添加可以使飼料中粗纖維的消化率明顯改善（李娟等，2014）。以還原糖含量和pH 作為指標，設計單酶和混合酶發酵試驗，得出最佳酶制劑添加比例為纖維素酶：葡聚糖酶=1∶1。確定最佳混合酶制劑添加比例的基礎上， 設置添加總量梯度發酵試驗， 得出酶制劑的最佳添加總量為200 U/g。

菌酶協同發酵飼料底物效果可受多種因素影響， 如發酵溫度、 接種量、 料水比等（Jamal 等，2012）。 發酵過程中一定程度升溫可加速微生物的生長，但是當溫度增長到一定程度時，會使酶制劑的酶活降低，反而影響發酵效果（Yazdi 等，2013）。 接菌量低會因微生物濃度過低減緩生長速度，但是接菌量過大，會加快營養物質消耗，而影響代謝物質的累積（蘭光群，2020）。 發酵過程中合適的液體比例也可以維持氧氣交換，營造良好的發酵環境。 粗纖維、粗蛋白質、粗脂肪是飼料中的基本營養物質， 可將其作為指標來驗證菌酶協同發酵效果。

4 結論

菌酶協同發酵玉米副產品飼料的最佳參數為釀酒酵母、植物乳桿菌1∶1 添加，纖維素酶、葡聚糖酶1∶1 添加，酶制劑添加量為200 U/g，發酵溫度30 ℃，料水比1∶1.2（g/mL），接菌量12%。 發酵玉米副產品型飼料可使粗蛋白質含量增加26.6%，粗脂肪含量增加30.8%，粗纖維含量降低25.4%。 本研究認為用菌酶協同的發酵方式可使飼料中營養成分含量有效增加， 為玉米副產品型飼料提供了一種有效發酵工藝。