體外染色體畸變試驗染色體標本制備的質量控制

賈慶文，英 永，馬 會，朱春花，高 梅,2*

(1.山東省藥學科學院，山東省化學藥物重點實驗室，濟南 250101； 2.山東師范大學生命科學學院，山東省動物抗性生物學重點實驗室，濟南 250014)

染色體是細胞核中遺傳物質的主要載體，環境中有害因素或致突變物作用于機體或培養的細胞后可導致染色體畸變，體外細胞染色體畸變試驗，是一項致突變性試驗，用于檢測體外細胞染色體畸變，以評價受試物致突變的可能性，亦是藥物遺傳指導原則推薦的評價藥物遺傳毒性的重要體外試驗[1]。中國倉鼠肺成纖維細胞(CHL)，易在體外建立細胞系，便于控制試驗條件，重復性好，自發突變率低，染色體數目正常非突變型為25條，便于分析，是進行染色體畸變試驗常用細胞。CHL細胞體外染色體畸變試驗在整個試驗過程中，特別是收獲細胞制備染色體玻片過程中，操作步驟繁瑣，時間較長，任何一個步驟操作不當，均可能影響制備的染色體標本的最終效果，甚至導致試驗失敗。本實驗室經過長期的試驗和不斷探索，制作的染色體標本分散良好，長短適用，質量穩定，為染色體的核型分析及進一步研究染色體的數目、結構畸變奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞株

中國倉鼠肺細胞(CHL細胞)購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養基，Gibco公司；新生牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；注射用絲裂霉素，北京索萊寶科技發展有限公司；注射用環磷酰胺，江蘇盛迪醫藥有限公司；S9，Moltox公司。

Thermo 3111二氧化碳細胞培養箱，Thermo Scientific公司；BDS200倒置生物顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限責任公司；DM LS2顯微鏡，德國Leica公司；SW-CJ-2FXS超凈工作臺，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 試驗前質量控制

對所用細胞進行細胞支原體及核型檢查，確認無支原體污染，畸變率<5%方可用于實驗。

1.3.2 試驗中質量控制

1.3.2.1 細胞培養

細胞置RPMI 1640培養基中培養，每500 mL RPMI 1640培養基中加入青霉素、鏈霉素各每毫升100單位，按10%加入新生牛血清配成完全培養液。試驗前1 d，取生長良好的CHL細胞，接種于25 cm2細胞培養瓶(每瓶5 mL)，接種濃度為每毫升105個，置37℃、5% CO2培養箱中培養過夜。

1.3.2.2 細胞與受試物的接觸

陰性對照組：1640完全培養基。陽性對照組：不加S9混合液時為注射用絲裂霉素，染毒6 h濃度為0.15 μg/mL，染毒24 h濃度為0.05 μg/mL；加S9混合液時為注射用環磷酰胺，濃度為10 μg/mL，染毒6 h[2-3]。細胞放入37℃、5% CO2箱，染毒6 h和24 h換液，洗3遍。各組于終止培養前4 h加入秋水仙堿，終濃度為0.4 μg/mL。

1.3.2.3 染色體標本的制作[4-5]

收集細胞：棄去細胞培養液，用PBS洗滌2次。胰酶消化，待細胞從瓶壁脫落時終止消化，將細胞懸液轉移至玻璃離心管中，混勻，1000 r/min離心5 min，棄去上清液。

低滲：在離心管中加入0.075 mol/L KCl溶液8 mL，吹打細胞(動作宜輕，否則易致細胞破裂)，使細胞分散成懸浮狀態，將離心管放入于37℃水浴中低滲10～20 min，后加入甲醇和冰醋酸(3∶1)固定液1 mL預固定，1000 r/min離心10 min，棄去上清液。

第一次固定：加入固定液6 mL，混勻；固定20 min，1000 r/min離心10 min，倒掉上清液.

第二次固定：再次加入固定液6 mL，混勻；固定20 min，1000 r/min離心10 min，倒掉大部分上清液。吸管吹打混勻細胞沉淀物，制成0.5～1.0 mL細胞懸液。

制片：先將洗凈的載玻片保存于冰水中備用。自冰水中取出載玻片，傾斜放置，吸取細胞懸液滴在玻片一端約1/3處，輕吹細胞懸液使之擴散。在酒精燈上微火加熱玻片底部(無細胞的一面)，使細胞固定于玻片上，空氣中自然晾干。

染色：將玻片放入Giemsa工作液中，染色10～20 min，然后取出玻片用水沖洗，置空氣中晾干。

1.3.3 閱片質量控制

試驗各組選擇分散較好的200個中期分裂相細胞，記錄染色體形態的變化。染色體結構畸變類型主要包括裂隙(在計算染色體畸變率時不計入其中)、斷裂、斷片、缺失、微小體、環狀染色體、單體互換等，結果以百分率(%)表示。細胞畸變率(%)=(細胞畸變數/分析細胞總數)×100%。染色體的選擇：先在低倍鏡下選擇細胞完整、輪廓清晰，染色體無重疊、分布良好的載玻片，再用高倍鏡進行分析。染色體畸變判斷標準：細胞畸變率<5%為陰性(-)；細胞畸變率>5%為可疑(±)；細胞畸變率>10%為陽性(+)；細胞畸變率>20%為陽性(++)；細胞畸變率>50%為陽性(+++)[6]。

2 結果

本實驗室近年來細胞染色體畸變試驗標本制備成功率較高，染色體形態和分布良好，長短適中，便于分析(見圖1、圖2)。陰性對照組在有S9和無S9兩種測試條件下，染色體結構畸變率均小于5%；注射用絲裂霉素在0.15 μg/mL濃度下，CHL細胞染色體畸變率為22.5%～41.5%，在0.05 μg/mL濃度下染色體畸變率為21.5%～42%；環磷酰胺在10 μg/mL濃度下，并有S9活化條件下染色體畸變率為25.5%～37.5%。陽性誘變劑誘發的CHL細胞染色體畸變率顯著增高。染色體畸變試驗失敗或制備的染色體影響鏡檢，導致試驗失敗的因素也很多，總結實驗過程中的失敗案例，主要有以下幾個原因：

一是細菌污染。在器皿消毒不徹底、細胞培養、加入培養液、培養液污染、培養觀察時被細菌污染，此時所培養的細胞因缺少營養或培養液中有毒代謝產物堆積而逐漸死亡，導致實驗失敗。或者細胞培養前期未受污染，而在加入受試物或更換培養液培養時被細菌污染(后期污染)，此時仍可見染色體[7]。(見圖3)。

二是染色體聚集。秋水仙素用量太多，會導致染色體的過分凝縮；低滲時間不足則染色體聚集在一起，分散不開；滴片時細胞懸液濃度過濃；細胞懸液未充分吹打均勻；載玻片未在冰水中浸泡；滴片高度距離不夠。(見圖4)。

三是染色體分散過度。低滲時間過長；離心速度過高；離心后吹打用力過大；滴片距離過高。使細胞膜破裂，導致染色體過度分散。(見圖5)。

圖1 分散良好的染色體標本(×200)Fig.1 Well dispersed chromosome specimens

圖2 分散良好的染色體標本(×400)Fig.2 Well dispersed chromosome specimens

圖3 污染的染色體標本(×200)Fig.3 Contaminated chromosome specimens

圖4 染色體聚集的標本(×200)Fig.4 Aggregated chromosome specimens

圖5 染色體分散過度的標本(×200)Fig.5 Excessively scattered chromosome specimens

3 討論

體外染色體畸變試驗中，所制備的染色體成功與否，主要有幾個判斷點，①細胞完整，輪廓清晰，染色體分布在同一水平面上。②染色體形態和分布良好，染色體長短適中。③最好無重疊，即使有個別重疊，也要能明確辨認。④所觀察的細胞處于同一有絲分裂階段，即染色體螺旋化程度或染色體長短大致相同。⑤在所觀察的細胞周圍，沒有離散的單個或多個染色體存在，以免影響計數。

通過試驗過程中的質量控制，可顯著提高染色體標本的質量及畸變的檢出率。影響染色體標本制備的因素很多，可從以下幾個方面進行質量控制：

3.1 CHL細胞培養

顯微鏡下生長良好的細胞透明度大、折光性強、輪廓清晰。生長不良時，胞質中常出現空泡、脂滴和其他顆粒狀物質，細胞間空隙加大、細胞形態不規則。若因缺乏營養，使細胞營養不良而導致細胞分裂較少或停止分裂或細胞死亡；培養時間過長，不及時收獲細胞，而導致細胞多層重疊，細胞老化或死亡，直接影響試驗質量。CHL細胞用1640培養液培養，pH 7.2～7.4，小牛血清的加入量一般為10%～20%；及時鏡檢細胞生長情況，密度不應過大，一般單層覆蓋培養容器表面，細胞之間有一定的間隙時，即可收獲細胞。

3.2 秋水仙素處理

染色體畸變試驗中加入秋水仙素的劑量、作用時間與獲得的中期細胞數量、染色體長短密切相關。加入秋水仙素的量過多，作用時間過長，會導致染色體過分凝縮，長度短小；加入的秋水仙素劑量過小，作用時間過短，則分裂中期分裂細胞少甚至無中期分裂相，染色體稀少。若秋水仙素劑量大，則作用時間短；秋水仙素劑量小，則作用時間適當延長[8-10]。

3.3 低滲

低滲處理是染色體玻片制備的關鍵環節。低滲時間過長，可引起細胞破裂，染色體分散在整個片子，染色體丟失；低滲時間不足，細胞膨脹度不夠，染色體聚集呈團狀，分散不好，不利于核型分析。此外，外界溫度對低滲效果也有影響，夏天低滲時間稍短，冬天可適當延長[8-10]。

3.4 離心

離心時離心力不能太高，低滲后細胞膨脹，離心速度過高，細胞容易破裂，導致染色體丟失；離心速度過低，則細胞不能沉淀，收集不到細胞[11-13]。

3.5 固定

固定的目的是維持染色體的形態，固定液采用甲醇:冰醋酸=3∶1，需現用現配。固定液須緩慢加入低滲后的液體中，吹打細胞，使細胞分散成懸浮狀態，吹打動作易輕柔，因低滲后細胞通透性增強，如果動作幅度過大，細胞容易破裂。固定時先要預固定，此步驟雖簡單卻很不能省略，可防止細胞在加入大量固定液時凝結成塊，隨后再固定2次。固定處理需保證足夠的固定液用量及固定時間，以及細胞與固定液的充分混勻[14]。

3.6 滴片

滴片時先用固定液制成細胞懸液，適當調整懸液濃度，固定液的加入量應視細胞而定。滴片用的玻片應提前冷凍或在冰水中浸泡，且清洗干凈，滴片高度為30～50 cm為宜，高度過低，染色體分散不開，過高則細胞膜破裂，導致染色體分散過度。吸取細胞懸液滴在玻片一端約1/3處，輕吹細胞懸液使之擴散，這樣可使染色體分散較好。在酒精燈上微火加熱玻片底部(無細胞的一面)，使細胞固定于玻片上[15-16]。

3.7 染色

染液使用Giemsa原液與9份磷酸緩鹽沖液(pH 7.4)混合而成，臨用時配制，染色10～20 min。染色完畢，立即用自來水輕輕沖洗干凈玻片上的染料，再用純水沖洗，用紗布或濾紙擦干玻片背面的水滴，空氣中自然晾干。pH太高，染色體易被染成藍色，不易觀察，染液濃度過高、染色時間太長，染色體著色太深，影響染色體結構的觀察[17]。

總之，目前染色體制備過程沒有統一的質量控制標準，各實驗室環境質量、人員技術、所用試劑品質，均能影響所制備的染色體標本質量。各實驗室應結合自己實驗室情況，不斷加強人員培訓，提高制備成功率。體外染色體畸變試驗細胞染色體標本制備的每一個步驟都很關鍵，必須嚴格按照操作規程，掌握每一個步驟的原理，細致、耐心、科學地操作，才能制備出好的標本，為今后實驗研究提供可靠的實驗數據。

參考文獻：

[1] 【ZH】GPT2-1, 藥物遺傳毒性研究技術指導原則 [S]. 國家食品藥品監督管理局， 2007

[2] Kasamatsu T, Ogura R, Ikeda N, et al. Genotoxicity studies on dietary diacylglycerol (DAG) oil [J]. Food Chem Toxicol, 2005, 43(2): 253-260．

[3] Hori H, Takayanagi T, Kamada Y, et al. Genotoxicity evaluation of sesamin and episesamin [J]. Mutat Res, 2011, 719(1-2): 21-28.

[4] 袁伯俊, 王治喬. 臨床前安全性評價與實踐 [M]. 第1版. 北京: 軍事醫學科學出版社, 1997: 89-102.

[5] 袁伯俊, 廖明陽, 李波. 藥物毒理學實驗方法與技術 [M]. 北京: 化學工業出版社, 2007: 268-271.

[6] 彭雙清, 郝衛東. 藥物安全性評價關鍵技術 [M]. 第1版. 北京: 軍事醫學科學出版社, 2013: 238-240.

[7] 昌業偉, 李鳳, 唐瑜, 等. 人外周血染色體標本制備方法影響因素的分析 [J]. 中國優生與遺傳雜志, 2014, 22(5): 148-149, 13.

[8] 黃江玲, 林祥偉, 邱少雄, 等. 人外周血淋巴細胞培養及染色體制備的方法及成功率 [J]. 中國校醫, 2015, 29(7): 526-527.

[9] 莊建龍, 王元白, 莊倩梅.外周血染色體制備方法的探討 [J]. 國際檢驗醫學雜志, 2015, 36(17): 2558-2560.

[10] 劉星, 馮昆, 張青峰, 等. 小鼠骨髓細胞中期染色體標本制備方法的改進 [J]. 衛生職業教育, 2015, 33(18): 101-102.

[11] 謝桂芬, 鐘寶花. 人外周血染色體標本制備的問題分析 [J]. 航空航天醫學雜志, 2012, 23(6): 683-685.

[12] 趙小平, 陳紹坤, 黃燕, 等. 外周血淋巴細胞培養及染色體制備過程中的問題分析 [J]. 現代預防醫學, 2009, 36(11): 2108-2109, 2112.

[13] 王喜愛, 韓林, 王平, 等. 外周血淋巴細胞染色體標本制備的質量控制 [J]. 中國工業醫學雜志, 2009, 22(3): 228-229.

[14] 謝志威, 張晶, 李衛凱. 外周血染色體制備改良方法的應用 [J]. 國際檢驗醫學雜志, 2013, 34(1): 82-83.

[15] 崔向青, 馬鑫, 李麗, 等. 增加中期細胞數的染色體標本制備方法研究 [J]. 中國現代醫藥雜志, 2014, 16(7): 8-9.

[16] 趙淑娟, 龐有志, 白俊艷, 等. 禽類骨髓細胞染色體標本制備實驗方法的改進 [J]. 實驗動物科學, 2010, 27(2): 17-20.

[17] 黃燕, 趙小平, 余紅, 等. 動物骨髓細胞染色體標本制備失敗的原因分析 [J]. 生物學通報, 2006, 41(1): 52-53.