心房鈉尿肽對基因敲除小鼠移植黑色素瘤生長的抑制作用

亓翠玲，曹靜樺，何亞軍，李夢詩，李倩明，楊 揚，王麗京

(廣東藥科大學，基礎學院血管生物學研究所，廣州 510006)

心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)是De Bold等[1]于1981年首次在心房肌細胞中發現的，是鈉尿肽家族(NPs)被發現的第一個成員。之后發現了其他的成員，即腦鈉肽(BNP)[2]、C-型鈉尿肽(CNP)[3]和樹眼鏡蛇性鈉尿肽(DNP)[4]。ANP與細胞膜上的受體鳥苷酸環化酶相互作用，發揮了重要的生物學功能。ANP最主要的生物學作用是排鈉利尿，調節血壓及參與水鹽平衡等。研究表明ANP還具有其他生物學功能，如通過減少自由基的生成和抵制氧化應激反應，從而起到保護心肌的作用；通過重塑心肌結構，從而改善心力衰竭的癥狀；還可通過對子宮血管重塑，對生殖等發揮重要作用。但是，ANP對黑色素瘤生長的作用未見報道。作者利用C57BL/6J背景的ANP敲除小鼠建立黑色素瘤皮下移植瘤模型，研究ANP對黑色素瘤生長的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級ANP雜合子小鼠(ANP+/-)，雄性2只，雌性6只，6～8周齡，體重18～20 g，由耿建國教授提供。C57BL/6J小鼠，SPF級，雌性，10只，6～8周齡，體重18～20 g，購自廣東省醫學實驗動物中心[SCXK(粵)2008-0002]。小鼠飼養于廣東藥科大學實驗動物中心，動物實驗操作也在此進行[SYXK(粵)2012-0125]，并嚴格按照廣東藥科大學動物倫理要求進行動物實驗(福利倫理審查證號：gdpulac2015014)。

1.2 主要試劑與儀器

B16F10黑色素瘤細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中；Rabbit anti-mouse Ki67抗體及rabbit anti-mouse CD31抗體購自博士德生物工程有限公司；Mouse anti-rabbit IgG購自北京中杉金橋生物有限公司。

主要儀器有PCR儀(美國應用生物系統公司)；光學顯微鏡及照相系統(日本Olympus公司)；全自動生物組織包埋機(PR公司)；烤片機(PR公司)；石蠟切片機和冰凍切片機(德國徠卡儀器公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 ANP純合子敲除小鼠的建立

ANP純合子敲除小鼠由ANP雜合子小鼠相互配種構建所得。本實驗針對ANP基因設計了引物：引物1∶5′- CCT TCT ATC GCC TTC TTG ACG -3′；引物2∶5′- CTG TCC AAC ACA GAT CTG ATG -3′；引物3∶5′- CTG TTG CAG CCT AGT CCA CT -3′。反應條件為: 94℃預變性3 min, 94℃ 30 s, 64℃ 1 s, 72℃ 1 s; 35個循環；72℃充分延伸2 min。擴增產物為700 bp。

1.3.2 皮下移植瘤模型的建立

以C57BL/6J小鼠作為對照組，ANP敲除小鼠為實驗組。對數生長期的黑色素瘤B16F10細胞，用胰酶消化離心后，用無菌的PBS重懸細胞。用臺盼藍對細胞進行染色以確定死細胞數低于5%后，在小鼠的右上肢腋下皮下接種0.2 mL的黑色素瘤細胞(1×105個細胞)。在接種后第7天每天用游標卡尺測量移植瘤的最大徑(a)和最小徑(b)，移植瘤體積的計算公式為：0.52×ab2。在腫瘤細胞接種12 d時，處死小鼠，分離小鼠腫瘤組織，并稱重。

1.3.3 免疫組織化學染色

將小鼠的腫瘤組織石蠟包埋、切片后進行免疫組織化學染色。切片脫蠟、水化后，放于3% H2O2-甲醇液中，37℃浸泡30 min以消除內源性過氧化酶。PBS清洗3次后，高壓修復10 min。血清封閉50 min后，加 rabbit anti-mouse Ki67抗體或 rabbit anti-mouse CD31抗體，4℃過夜。PBS清洗3次后，加二抗，37℃孵育50 min。PBS清洗3次后，DAB染色，蘇木素復染后，常規脫水、透明、封片。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 ANP敲除小鼠的鑒定與擴群

本實驗所有小鼠均為ANP雜合子小鼠(ANP+/-)，用雄性ANP+/-小鼠與雌性ANP+/-小鼠雜交，子代有雜合子、純合子和野生型三種基因型小鼠。1、2、4和6號小鼠的電泳條帶大小為700 bp，為純合子小鼠；3號和5號小鼠電泳條帶大小為700 bp和434 bp，為雜合子小鼠。接著，用ANP-/-小鼠與ANP-/-小鼠配種，對ANP-/-小鼠擴群。

注：3號和5號小鼠條帶分別為700 bp和434 bp，為ANP雜合子小鼠，1號、2號、4號及6號小鼠的條帶為700 bp，為ANP敲除純合子小鼠。M：Marker 2000 bp；ANP-/-小鼠有一條帶為700 bp；ANP+/-小鼠有兩條帶，分別為700 bp和434 bp，野生型小鼠有一條帶為434 bp。圖1 ANP基因的鑒定圖Note.Lane 3,5: ANP+/- mice; Lane1, 2，4，6: ANP-/- mice.Fig.1 Identification image of ANP gene

2.2 ANP敲除抑制了黑色素移植瘤的生長

在ANP敲除小鼠和C57BL/6J小鼠皮下接種黑色素瘤B16F10細胞建立黑色素移植瘤模型，7 d后均形成明顯的腫瘤結節。成瘤后，每天測量腫瘤的長徑和短徑，計算小鼠的腫瘤體積，發現在對應的時間內ANP敲除小鼠的腫瘤體積明顯比C57BL/6J小鼠的腫瘤體積小(見圖2A)。在腫瘤接種12 d時，用斷頸法處死小鼠，分離小鼠腫瘤組織并稱重，發現ANP敲除小鼠的腫瘤重量明顯比C57BL/6J小鼠的腫瘤重量輕(見圖2B)。

注：與C57BL/6J小鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 ANP敲除對小鼠黑色素移植瘤的作用Note.Compared with the C57BL/6J mouse，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.2 The effect of ANP knockout on the transplanted melanoma in mice

2.3 ANP敲除對黑色素瘤腫瘤細胞增殖和腫瘤微血管密度的作用

小鼠腫瘤組織石蠟包埋、切片后，用Ki67及CD31抗體檢測腫瘤組織中增殖的細胞及血管。對于增殖細胞的統計，每張切片在400倍光鏡下拍照，每張切片隨機記錄4～5個視野，計數每個視野中陽性細胞數及全部細胞數，增殖指數為增殖細胞數占全部細胞數的比值。發現ANP敲除小鼠腫瘤組織中細胞增殖指數明顯比C57BL/6J小鼠少(圖3A)。關于微血管密度，每張切片在200倍光鏡下拍照，每張切片隨機記錄4～5個視野，計數每個視野中血管的數目，發現ANP敲除小鼠腫瘤組織中微血管數目明顯比對照組少(圖3B)。

3 討論

ANP是廣泛分布于心臟血管系統、中樞神經系統、免疫系統及腎臟組織中由心肌細胞合成和分泌的激素。ANP主要與NPRA結合，激活G蛋白和鳥苷酸環化酶，進而促進細胞內環磷酸鳥苷的生成[5-8]，從而利鈉利尿、舒張血管、降低血壓、參與脂質代謝及調節免疫等[9-12]。近年研究表明ANP還對纖維化、心肌缺血再灌注損傷等具有重要作用[13-14]。但是，ANP對腫瘤生長的作用尚未見報道。

為了確定ANP對黑色素瘤的作用，本研究利用ANP敲除小鼠建立了黑色素瘤皮下移植模型。利用基因工程小鼠建立腫瘤移植瘤模型具有其它模型無法比擬的優勢：可以在基因產物的作用完全消除的情況下，研究單個基因在動物體內對腫瘤的作用，更能模擬腫瘤在人類體內發生發展的過程。本實驗所用的基因工程小鼠為ANP敲除小鼠，在ANP敲除小鼠體內ANP的功能完全缺失。利用ANP敲除小鼠及其對照C57BL/6J小鼠建立的黑色素瘤皮下移植瘤模型，每組小鼠的腫瘤成功率可達100%，而且腫瘤生長速度較一致，個體差異也較小，而且腫瘤長于體表，易于觀察及測量腫瘤，可以客觀地判斷ANP對腫瘤生長的作用。

注：與C57BL/6J小鼠比較，**P< 0.01，***P< 0.01。圖3 ANP缺失抑制了腫瘤細胞增殖和腫瘤血管形成(Bar=100 μm)Note.Compared with the C57BL/6J mouse，**P< 0.01，***P< 0.001.Fig.3 Deletion of ANP inhibits tumor cell proliferation and tumor angiogenesis in the mice.

本研究利用ANP敲除小鼠建立的黑色素瘤皮下移植瘤模型，發現ANP敲除顯著抑制了黑色素瘤的生長。為了進一步確定ANP敲除抑制黑色素瘤的作用，我們用免疫組化檢測了腫瘤組織中增殖的細胞及微血管密度，發現ANP敲除后顯著抑制了腫瘤細胞的增殖及微血管的密度。所以，ANP敲除可能通過抑制腫瘤細胞的增殖及減少微血管的數目，從而抑制了黑色素皮下移植瘤的生長。

綜上所述，ANP缺失顯著抑制了黑色素瘤的生長，但其分子機制尚不清楚，需進一步研究。進一步探討ANP與腫瘤發生、發展的關系，將對于理想的抗腫瘤治療靶點及判斷患者預后具有重要意義，而且為ANP作為治療腫瘤患者的新型藥物提供了重要依據。

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