米蝦鞣化激素的表達特征分析及體外合成

任麗琦，翁潔羊，王 鑫，孫金生，李 冉

(天津師范大學生命科學學院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387)

許多節肢動物會發生周期性的蛻皮。當蛻去堅硬的、舊的外骨骼后由真皮分泌產生的新表皮比較柔軟，對動物生長有利，但是不能有力地抵抗病原微生物的侵染，甚至易受到其他機械損傷等，所以需要迅速進行鞣化(黑化和硬化)。

Cottrell[1]和Fraenkel等[2]最早發現了鞣化激素的功能，他們認為正常發育的紅頭麗蠅(Calliphoraerythrocephala)體內存在某種調節因子，這種調節因子可以使剛羽化的紅頭麗蠅在頸部進行結扎處理后，胸部和腹部的表皮仍能夠繼續鞣化。Fraenkel等[3]將該物質命名為鞣化激素(Bursicon)。研究發現鞣化激素在三氯乙酸、乙醇、丙酮等溶液中均會產生沉淀而且不能夠成功透析，乙醇和枯草桿菌又可將其滅活，證明鞣化激素屬于蛋白質。之后幾乎同時的2項研究表明鞣化激素是一種異源二聚體，由2個胱氨酸結蛋白亞基構成，分別被命名為BURS (α)和PBURS (β)[4-5]。α和β亞基都是胱氨酸結蛋白，2個亞基的氨基酸序列中都包含11個半胱氨酸，C3和C4間的氨基酸序列均為X-G-X (X可以為任意的氨基酸)，C6和C7相鄰，C9和C10間只有1個氨基酸，α和β這2個亞基通過C6結合在一起[4]。

在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中鞣化激素的受體，是一種G蛋白偶聯受體，即DLGR2，其由rickets基因編碼[6]。受體DLGR2被激活后，經由cAMP/PKA通路調控表皮的鞣化和翅的伸展[6-8]。利用基因芯片分析方法在頸部結扎黑腹果蠅中，找到了87個受鞣化激素調控的下游基因。其中已知功能的基因大多與表皮的鞣化以及翅的伸展有關，還有7個基因與免疫調控有關[9]。鞣化激素的2個亞基還可以分別形成各自的同源二聚體并參與免疫反應[10]。

在蛛形綱[11]、昆蟲綱[12-15]和甲殼綱[16-20]中都含有鞣化激素，而且鞣化激素主要分布在神經細胞中[15-20]。但是其在米蝦中的分布及其蛋白結構鮮有報道。米蝦屬于甲殼綱(Crustacea)、匙指蝦科(Atyidae)，具有繁殖周期短、生長快、個體小等特點，適合作為試驗材料。筆者選取米蝦為研究對象，觀察其胚胎的發育過程，實時熒光定量PCR檢測鞣化激素在米蝦不同組織中的分布，并利用原核表達的方式表達鞣化激素2個亞基基因的蛋白，為進一步研究鞣化激素在米蝦中的功能提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1材料米蝦購于浙江水產市場，每只體重50～100 mg，將米蝦養在實驗室26～28 ℃的曝氣水中，每日投喂2次蝦糧，每隔2 d更換新鮮的曝氣水。

1.2主要試劑TRIzol?Reagent購于Thermo Fisher Scientific；氯仿、異丙醇、無水乙醇等有機試劑購于普博欣生物科技有限責任公司；TransScript?one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購于北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶、ExTaq酶購于TaKaRa；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix購于南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、LB液體培養基、LB固體培養基、瓊脂糖、抗生素、無酶水、SDS、APS、TEMED等購于生工生物工程股份有限公司。

1.3主要儀器冷凍離心機(Eppendorf)、超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific)、PCR儀(Bio-Rad Laboratories)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、凝膠成像儀(Bio-Rad Laboratories)、電熱恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)、pH儀(METTLER TOLEDO)、高溫高壓滅菌鍋(天津億諾科學儀器有限公司)、超凈工作臺(Airtech)、恒溫培養振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)、生化培養箱(廣東省醫療器械廠)、超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)、蛋白膠電泳儀(ATTO Corpration)、水平搖床(太倉市科教器材廠)、7500FAST熒光定量PCR儀(ABI)。

1.4方法

1.4.1觀察米蝦胚胎發育過程。挑選個體較大、體質健壯、性成熟的米蝦作為親體，將雌雄按比例1∶2混養在同一蝦缸內，溫度維持在25 ℃。待雌蝦抱卵后單獨喂養。抱卵6 h時，蝦卵在水中進行離體培養。用顯微鏡觀察并拍照，記錄米蝦的胚胎發育進程。

1.4.2米蝦RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成。參考TRIzol?Reagent 試劑說明書提取米蝦的總RNA，超微量分光光度計測其濃度后，用1%瓊脂糖凝膠檢測RNA的提取質量。取2 μg RNA反轉錄形成cDNA的第一條鏈。選用β-actin內參基因(引物為β-actinF、β-actinR，表1)進行PCR檢測cDNA模板。

表1 試驗所用的引物序列

1.4.3bursicon-α和bursicon-β基因表達載體的構建。根據轉錄組提示，設計擴增bursicon-α、bursicon-β去掉信號肽后的ORF區的特異性引物bursicon-αF、bursicon-αR、bursicon-βF、bursicon-βR(表1)。由于后續試驗需要構建2個亞基基因的表達載體，所以在上游引物的5’端和下游引物的3’端分別引入了BamH I和Hind Ⅲ酶切位點。以反轉錄獲得的米蝦cDNA為模板，參照ExTaq酶說明書進行PCR擴增。bursicon-α反應條件是94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。bursicon-β的退火溫度是64 ℃，其余與bursicon-α相同。PCR產物經膠回收試劑盒切膠回收純化后和pMD18-T載體連接，構建pMD18-T-α、pMD18-T-β克隆載體并轉入DH5α中。參照質粒小提試劑盒說明書提取pMD18-T-α、pMD18-T-β以及pET-28a-c(+)質粒。用限制性內切酶BamH I和Hind Ⅲ雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的基因片段和酶切后的表達載體。回收的片段用T4連接酶連接，構建重組表達質粒pET-28a-α、pET-28a-β并轉入DH5α中。在加有卡那霉素的LB平板上篩選，挑取陽性克隆，并用雙酶切檢測。最后將陽性克隆菌液送到金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.4.4重組質粒pET-28a-α、pET-28a-β表達條件的優化。將測序正確的pET-28a-α或pET-28a-β重組質粒轉入Rosetta表達菌中。分別接這2種表達菌80 μL到6 mL的LB培養基中(培養基中加有卡那霉素和壯觀霉素)過夜培養，培養條件為37 ℃、220 r/min。次日復搖菌液到50 mL的培養基中,當OD值是0.6時，取1 mL菌液作為對照，之后加入IPTG誘導菌液表達。誘導條件選用16 ℃、150 r/min，IPTG終濃度為0.5 mmol/L時，分別取誘導3、8和24 h菌液各1 mL。誘導條件選用37 ℃、220 r/min，IPTG終濃度為1 mmol/L時，分別取誘導1、2、3、4、5和6 h的菌液各1 mL。將取到的菌液分別離心收集菌體，SDS-PAGE凝膠電泳進行檢測。

1.4.5重組蛋白Bursα和Bursβ的大量誘導與純化。將含有pET-28a-α或pET-28a-β重組質粒的Rosetta表達菌分別接入到600 mL的LB培養基中進行培養，培養條件為37 ℃、220 r/min。當OD值為0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG并在37 ℃下誘導，6 h后4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集菌體。菌體在破碎緩沖液BufferA中用超聲波破碎，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清。沉淀用洗滌緩沖液BufferB去除雜蛋白后溶解在含8 mol/L尿素的Wash I里。BufferA、BufferB和Wash I中的蛋白用SDS-PAGE凝膠電泳進行檢測。由于鎳柱可以與目的蛋白上的6個組氨酸標簽特異性結合，所以選用Ni-NTA純化目的蛋白，用洗脫緩沖液(咪唑的濃度為500 mmol/L)洗脫親和柱，收集洗脫峰液。對純化后的Bursα和Bursβ進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

1.4.6定量PCR分析米蝦鞣化激素在不同組織中的表達。依據轉錄組提示設計了bursicon-α和bursicon-β的定量PCR引物bursicon-αQPCR F、bursicon-αQPCR R、bursicon-βQPCR F、bursicon-βQPCR R(表1)。分別提取米蝦眼柄、心、胸神經節和腹神經節組織的RNA，并反轉錄獲得cDNA(方法同“1.4.2”)。分別以4個組織的cDNA為模板，利用實時熒光定量PCR儀檢測bursicon-α和bursicon-β在不同組織中的相對表達量。內參基因選用β-actin。每組數據重復3次，2-△△Ct法計算基因的相對表達量，用軟件SPSS17.0分析表達差異，最后用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1米蝦的胚胎發育過程將雌蝦剛剛開始抱卵時計為0 h，整個胚胎發育階段包括卵裂期、囊胚期、原腸期、前無節幼體期、后無節幼體期、復眼色素形成期以及蚤狀幼體期共7個時期(圖1)。在水溫約26 ℃時胚胎發育經歷大約19 d。

2.2米蝦Bursα和Bursβ重組蛋白的表達

2.2.1表達質粒pET-28a-α、pET-28a-β的構建及鑒定。將bursicon-α和bursicon-β編碼信號肽的核酸序列去掉后，序列片段大小分別為363、348 bp。構建的表達質粒pET-28a-α、pET-28a-β用BamH I和Hind Ⅲ進行雙酶切鑒定，結果α和β目的片段的大小符合預期試驗結果(圖2)。表達質粒經測序后與轉錄組中2個亞基的核苷酸序列在BioEdit軟件中進行比對，發現核苷酸序列沒有產生突變，說明表達質粒構建成功。

注：1.卵裂期；2.囊胚期；3.原腸期；4.前無節幼體期；5.后無節幼體期；6.復眼色素形成期；7.蚤狀幼體期；8.米蝦幼體Note:1.cleavagestage; 2.blastula; 3.gastrula; 4.egg-nauplius stage; 5.egg-metanauplius stage; 6.embryo with eye pigments formed stage; 7.prehatching stage; 8.the larvae of Caridina圖1 米蝦胚胎發育過程Fig.1 The process of embryo development in Caridina

注：M.DL2000標記；1.pET-28a-α重組質粒雙酶切產物；2.pET-28a-β重組質粒雙酶切產物Note:M.DL2000 Marker;1.double enzyme products of pET-28a-α recombinant plasmid; 2.double enzyme products of pET-28a-β recombinant plasmid圖2 重組質粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombined plasmid by restriction enzyme

2.2.2重組蛋白Bursα、Bursβ表達條件的篩選。為了促使bursicon-α和bursicon-β在Rosetta菌中的表達，對IPTG的濃度、溫度等各種原核表達的條件進行了探討。α亞基去掉信號肽后蛋白的相對分子量大小約13.15 kD，加上表達載體pET-28a-c(+)上的His標簽蛋白后，重組Bursα蛋白的相對分子量大小約16.70 kD；β亞基去掉信號肽后蛋白的相對分子量大小約12.70 kD，加上表達載體pET-28a-c(+)上的His標簽蛋白后，重組Bursβ蛋白的相對分子量大小約16.24 kD。SDS-PAGE凝膠電泳檢測發現：當誘導條件為16 ℃、150 r/min，IPTG終濃度為0.5 mmol/L時，pET-28a-α在誘導24 h后依然只有少量表達，pET-28a-β基本沒有表達(圖3)；當誘導條件為37 ℃、220 r/min，IPTG終濃度為1 mmol/L時，pET-28a-α和pET-28a-β表達量隨著誘導時間的增加而逐漸增多(圖4)。

2.2.3重組蛋白Bursα、Bursβ大量表達及純化。比較不同誘導條件下目的蛋白的表達結果，選用在220 r/min、37 ℃，IPTG終濃度為1 mmol/L的條件下，大量誘導表達Bursα和Bursβ。SDS-PAGE凝膠電泳對BufferA、BufferB和Wash I中的蛋白進行檢測。結果顯示bursicon-α以包涵體的形式大量表達，而bursicon-β則可以在上清中表達，形成可溶性蛋白(圖5)。目的蛋白經Ni SephroseTM 6 Fast Flow純化后，SDS-PAGE電泳顯示，在10～25 kD間有一條單一的蛋白條帶，和預期大小基本相同。結果說明獲得了較純的Bursα和Bursβ重組蛋白(圖6)。

注：A為α亞基蛋白，M.蛋白分子量標準，1～4.誘導時間分別為0、3、8、24 h的α亞基菌體蛋白；B為β亞基蛋白，M.蛋白分子量標準，1～4.誘導時間分別為0、3、8、24 h的β亞基菌體蛋白Note:A was Bursα,M.protein molecular weight marker (kD),1-4.the bacteria that inserted into the pET-28a-α vector induced at 0,3,8 and 24 h respectively;B was Bursβ,M.protein molecular weight marker (kD),1-4.the bacteria that inserted into the pET-28a-β vector induced at 0,3,8 and 24 h respectively圖3 在16 ℃條件下Bursα和Bursβ重組蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analyses of the recombinant Bursα and Bursβ expressions at 16 ℃

注：A.α亞基蛋白,M.蛋白分子量標準，1～7.誘導時間分別為0、1、2、3、4、5、6 h的α亞基菌體蛋白；B.β亞基蛋白,M.蛋白分子量標準，1～7.誘導時間分別為0、1、2、3、4、5、6 h的β亞基菌體蛋白Note:A.Bursα,M.protein molecular weight marker (kD),1-7.the bacteria that inserted into the pET-28a-α vector induced at 0,1,2,3,4,5 and 6 h respectively;B.Bursβ,M.protein molecular weight marker (kD),1-7.the bacteria that inserted into the pET-28a-β vector induced at 0,1,2,3,4,5 and 6 h respectively圖4 在37 ℃條件下Bursα和Bursβ重組蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.4 SDS-PAGE analyses of the recombinant Bursα and Bursβ expressions at 37 ℃

2.2.4鞣化激素在不同組織中表達的差異。以米蝦眼柄、心、胸神經節和腹神經節4種組織的cDNA為模板，用實時熒光定量PCR檢測鞣化激素2個亞基基因bursicon-α和bursicon-β的表達情況。結果表明，bursicon-α和bursicon-β均在腹神經節中的相對表達量較高，胸神經節次之，眼柄和心中的相對表達量均較低(圖7)。

3 結論與討論

米蝦生活在淡水中，對水溫和pH的適應范圍較廣。但是觀察發現在水溫較低時，米蝦的生殖腺發育緩慢，所以溫度的高低可能對生殖腺的發育有一定的影響。此外，對米蝦的胚胎發育研究表明，胚胎發育所需要的時間也與水溫密切相關。當水溫維持在26 ℃左右時，米蝦整個胚胎發育過程的時間較短，僅需約19 d。該溫度可能是米蝦生長的最適溫度。因為米蝦個體小、繁殖快、易飼養，所以適合作為試驗材料。

筆者以米蝦為研究對象，利用BamH I和Hind Ⅲ限制性內切酶，成功構建了鞣化激素2個亞基基因的表達載體pET-28a-α和pET-28a-β。將表達載體導入Rosetta表達菌中后，通過對表達條件的篩選發現在37 ℃、220 r/min，IPTG終濃度為1 mmol/L時，能夠大量表達Bursα和Bursβ蛋白。An等[9]研究發現黑腹果蠅體中鞣化激素2個亞基基因蛋白大約為15 kD。將重組BURS和PBURS蛋白分別注射到頸部結扎的黑腹果蠅體內會對一些免疫相關基因的表達產生影響。在甲殼綱的藍蟹(Callinectessapidus)中鞣化激素2個亞基基因蛋白也大約為15 kD。取其處于蛻皮后期D2期和蛻皮期E期時新形成的角質層，然后用表達獲得的鞣化激素蛋白去進行孵育。發現與對照組相比角質層明顯增厚，表明鞣化激素參與角質層的硬化。在該試驗中將原核表達獲得的Bursα和Bursβ重組蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結果顯示Bursα和Bursβ重組蛋白的相對分子質量分別為16.70 kD和16.24 kD，與果蠅和藍蟹中鞣化激素亞基的分子量大小相近，而且表達純化后的Bursα和Bursβ蛋白為下一步研究鞣化激素對角質層及免疫系統的作用打下了基礎。

注：M.蛋白分子量標準，1～5.導入pET-28a-α質粒的菌體蛋白(1～2.BufferA，3.BufferB，4～5.Wash I)；6～11.導入pET-28a-β質粒的菌體蛋白(6～7.BufferA，8～9.BufferB，10～11.Wash I)Note:M.protein molecular weight marker (kD),1-5.the bacteria that inserted into the pET-28a-α vector(1-2.BufferA，3.BufferB，4-5.Wash I); 6-11.the bacteria that inserted into the pET-28a-β vector (6-7.BufferA，8-9.BufferB，10-11.Wash I)圖5 Bursα和Bursβ重組蛋白純化前SDS-PAGE電泳分析Fig.5 SDS-PAGE analyses of the recombinant Bursα and Bursβ expressions before purification

注：M.蛋白分子量標準；1.α亞基蛋白；2.β亞基蛋白Note:M.protein molecular weight marker (kD); 1.Bursα; 2.Bursβ圖6 Bursα和Bursβ重組蛋白純化后SDS-PAGE電泳分析Fig.6 SDS-PAGE analyses of the recombinant Bursα and Bursβ expressions after purification

注：ES.眼柄；HT.心；TG.胸神經節；AG.腹神經。不同小寫字母表示組內存在顯著性差異(P<0.05)Note：ES.Eyestalk；HT.Heart；TG.Thoracic ganglia；AG.Abdominal ganglia.Different lowercase letters indicate statistically significant differences within the group圖7 米蝦bursicon-α和bursicon-β在不同組織中的相對表達量Fig.7 The relative expression levels of bursicon-α and bursicon-β in different tissues from Caridina

美洲大蠊(Periplanetaamericana)胸部和腹部神經系統可以合成甲殼動物心臟激活肽(CCAP)和鞣化激素。在煙草天蛾(Manducasexta)中也發現胸部和腹部的神經節以及食管下神經節的唇部和上頜部神經節均能表達CCAP和鞣化激素。其中在煙草天蛾的幼蟲階段只有腹部神經節第一節表達鞣化激素，然而到了蛹期，腹部各個神經節都能表達鞣化激素。同樣在黑腹果蠅中也有類似的情況，處于幼蟲階段時腹部神經節只有前4節表達鞣化激素，在蛹期時腹部神經節中表達鞣化激素的有14個細胞。此外在歐洲龍蝦(Homarusgammarus)、藍蟹以及斑節對蝦(Penaeusmonodon)等甲殼動物中也發現鞣化激素主要是在胸腹神經節中合成。而在該試驗物種米蝦中，利用實時熒光定量PCR檢測米蝦不同組織中鞣化激素的表達量，結果表明鞣化激素主要在腹神經節中表達，在胸神經節中也有一定的表達量。這與在果蠅及其他蝦蟹類中的研究是一致的。由于鞣化激素是分泌蛋白，猜測鞣化激素可能由胸腹神經節分泌到血淋巴中發揮作用。

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