凡納濱對蝦絲氨酸蛋白酶基因(Lv-SP)的克隆及表達分析

宋巧珍，鄒枘峰，張亦陳，耿緒云，劉逸塵 *

(1.天津市動植物抗性重點實驗室/天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津市水生動物疫病預防控制中心，天津 300221)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦(Pacific White Shrimp)，隸屬于節肢動物門、甲殼綱，其具有生長快、繁殖期長、含肉率高和便于活蝦運輸等特點，是世界范圍內對蝦養殖的三大品種之一[1]。但近年來，在病原活躍、養殖環境惡化和宿主抵抗力下降三方面因素共同作用下，對蝦病害頻發，給我國養殖產業造成了巨大的經濟損失，因此深入開展對蝦免疫防御機制研究，增強其抗病能力，顯得尤為重要。

凡納濱對蝦屬于無脊椎動物，缺乏獲得性免疫系統，只能依靠天然免疫系統(細胞免疫和體液免疫)來抵御和殺死入侵的病原[2-3]。其體液免疫主要利用凝血級聯反應、酚氧化酶激活系統等一系列效應因子參與免疫應答反應[4]。此外，蝦蟹類體內的一些其他組分如絲氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑等分子會作為級聯反應中的調控因子參與免疫反應。絲氨酸蛋白酶家族作為一種蛋白水解酶，其以絲氨酸為活性中心，在生物有機體中起著重要的作用[5-6]。clip-SP家族在氨基端含有1個clip結構域，此結構域最初在馬蹄蟹的凝固酶原中被發現，研究結果發現它在免疫反應中具有重要調節功能[7]，其中6個半胱氨酸可形成3個鏈內二硫鍵[8-9]；羧基端含有絲氨酸蛋白酶樣結構域(SP結構域)，其中絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸這3個氨基酸會形成催化三聯體發揮作用。無脊椎動物中，絲氨酸蛋白酶家族在胚胎發育和防御反應的信號級聯反應中發揮重要作用，例如馬蹄蟹的凝血反應[10]、果蠅抗菌肽的合成[11]、昆蟲和甲殼綱動物中酚氧化酶原系統的激活等[12-13]。同時，補體系統(包括經典途徑、凝集素途徑和旁路途徑)必須先通過一系列絲氨酸蛋白酶(serine proteases,SP)的酶促級聯反應激活后才能發揮生物學效應。經典途徑中，對抗原抗體復合物(IC)的識別由C1q介導，其中的SP主要是C1r和C1s；凝集素途徑中，識別分子是甘露糖結合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)[14-15]，MBL識別并結合外源病原物質，進一步與MBL相關的SP(MBL Associated Serine Proteinase,MASP)結合形成復合物并激活補體因子C3，形成膜攻擊復合物(MAC)，導致異源微生物裂解死亡，進而發揮免疫作用[16-17]。該研究擬獲得凡納濱對蝦Lv-SP基因，探討序列特點及組織分布特征，并分析其應答病毒侵染的表達變化模式，以期為深入探討其作為免疫調控基因在對蝦防御應答過程中的作用機制奠定基礎，并應用于對蝦的健康養殖和病害防治。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究材料。健康的凡納濱對蝦(購于天津市西青區對蝦養殖基地)，體長11～14 cm，體重9～14 g，于實驗室循環養殖系統中(16 ℃，鹽度10‰，氧氣充足)暫養4～5 d再進行試驗。

1.1.2載體和菌株。pMD18-T-Vector (TaKaRa )，大腸桿菌DH5α菌種由天津師范大學水生生物學研究室保存。

1.1.3主要試劑。SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工)、ExTaq酶(TaKaRa)、2×TaqPCR Master Mix (Promega)、LB液/固體培養基(生工)、M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)、GoTaq?MasterMix (Promega)、T4DNA連接酶(TaKaRa)等。

1.1.4主要儀器。PCR儀(BIO-RAD)、電泳儀(DYY-6C)、超凈工作臺(SW-CJ-1FD)、7500 Fast Real-Time PCR system(Applied Biosystems)、移液器(Eppendorf)等。

1.2方法

1.2.1凡納濱對蝦總RNA提取及cDNA合成。利用Trizol方法提取凡納濱對蝦血細胞、肝、鰓等組織的RNA，用于后期基因克隆操作，經1% MOPs瓊脂糖凝膠電泳進行定性檢測，再通過NANO Drop 2000分光光度計進行定量檢測，確認RNA濃度和完整性后利用M-MLV Reverse Transcriptase 反轉錄體系并且加入接頭引物BDA、AOLP(表1)進行cDNA的合成。

1.2.2引物設計與Lv-SPORF區域的擴增。從實驗室前期凡納濱對蝦轉錄組測序結果中篩選出SP基因進行引物設計(生工)，引物包括Lv-SPF1、Lv-SPR1和Lv-SPF2、Lv-SPR2(表1)共2對。利用PCR技術擴增目的基因，電泳檢測后將PCR產物利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進行純化后連接到pMD18-T-Vector上，轉入到大腸桿菌DH5α中，送英濰捷基公司進行測序，利用Bioedit軟件和在線BLAST程序分析測序結果與目的基因是否一致，進而確定是否獲得Lv-SP基因ORF區。

1.2.3生物信息學分析。首先利用Expasy的在線分析工具(http://web.expasy.org)對Lv-SP基因ORF區進行翻譯獲得蛋白質序列、預測其分子量及等電點、利用其SMART程序分析Lv-SP蛋白的功能結構域，并利用其SignalP 4.1 Server分析其是否含有信號肽，通過TMHMM 2.0對Lv-SP蛋白序列進行跨膜分析。使用Bioedit、ClustalX 1.83以及MEGA 6.0軟件對Lv-SP氨基酸和其他物種如中國明對蝦、中華絨螯蟹、果蠅等的SP、SPH氨基酸序列進行多重比對，并使用Neighbour-Joining法構建系統進化樹(Bootstrap=10000)。

1.2.4Lv-SP基因組織表達分析。根據克隆的Lv-SP基因序列，設計熒光定量PCR試驗組引物Lv-SPqf，Lv-SPqr和對照組引物β-actinf，β-actinr(表1)，將凡納濱對蝦各組織提取的RNA反轉成濃度相近的cDNA，參考GoTaq?MasterMix說明，利用熒光定量PCR方法檢測Lv-SP基因在凡納濱對蝦不同組織中表達量的差異。定量PCR反應體系設計為GoTaq?MasterMix 12.5 μL，Nuclease-Free Water 8.50 μL，引物1 μL，cDNA 2 μL，總體積25 μL。定量PCR反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，40個循環；最后進行融解曲線分析。所獲得的數據利用2-△△Ct法和t檢驗方法進行統計分析并計算Lv-SP基因相對表達量的顯著性差異。

1.2.5人工感染白斑桿狀病毒(WSSV)對凡納濱對蝦Lv-SP基因表達的影響。人工感染克氏原螯蝦富集足量的WSSV病毒，并稀釋到105拷貝數/μL。從試驗組和對照組各選取50只經檢測的健康凡納濱對蝦，分別注射10 μL WSSV 和Tris-NaCl緩沖液(TN-buffer，用于稀釋WSSV)，分別在注射后0、0.5、5.0、12.0、24.0、48.0和72.0 h抽取對蝦血淋巴，提取血細胞RNA并反轉錄制備cDNA，設計對照組引物TPI-qf，TPI-qr(表1)，利用qPCR分析凡納濱對蝦Lv-SP基因的表達變化特征(方法同“1.2.4”)。

表1 試驗所用引物

2 結果與分析

2.1Lv-SP基因cDNA序列特征及生物信息學分析Lv-SP基因包含1個1 104 bp的ORF區，編碼367個氨基酸(圖1)，預測其蛋白分子量為41 kD，等電點為6.93。SignalP 4.1 Server預測結果顯示：Lv-SP氨基酸序列氨基端含有23個氨基酸的信號肽，同時TMHMM 2.0預測顯示Lv-SP蛋白位于細胞外發揮作用。SMART預測結果顯示Lv-SP蛋白含有1個clip結構域和1個高度保守的TryP-SPc結構域。在clip結構域中，包含6個半胱氨酸，可以形成3個二硫鍵；在TryP-SPc結構域中，包含SP家族中3個典型的氨基酸組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和絲氨酸(Ser)，形成催化三聯體發揮功能。

注：藍色方框表示信號肽，黑色下劃線表示clip結構域，紅色下劃線表示TryP-SPc結構域，黑色方框表示6個半胱氨酸(C)，紅色方框表示組氨酸(H)、天冬氨酸(D)和絲氨酸(S)Note：The sequence in blue box represents the signal peptide,the clip domain is underlined by black line,the TryP-SPc domain is underlined by red line,the bases (C) in black box represents six cysteines and the bases in red box represents histidine (H),aspartic acid(D) and serine (S)圖1 Lv-SP基因的cDNA序列及相應蛋白的氨基酸序列Fig.1 The ORF cDNA sequence and the corresponding amino acid sequence of Lv-SP

2.2Lv-SP的多重序列比對及進化發生分析將Lv-SP氨基酸序列與其他物種SP氨基酸序列進行多重比對(圖2)發現，這12種SP及SPH序列在蛋白水平上具有較高序列相似性。進一步構建系統發生樹顯示：Lv-SP蛋白與南美白對蝦、中華絨螯蟹相似性比較高，親緣關系比較近，進化上為一個亞群；而與按蚊、小蜂窩甲蟲親緣關系比較遠(圖3)。

2.3Lv-SP基因的組織表達分析利用RT-PCR分析Lv-SP基因在不同組織中的表達水平，結果顯示：該基因在凡納濱對蝦的血細胞、肝、鰓、胃等9個組織中均有表達，其中在鰓和血細胞中的表達量較高，在心和肝中表達量較低(圖4)。

2.4WSSV侵染對凡納濱對蝦Lv-SP基因表達的影響WSSV的體內人工感染試驗結果顯示，注射WSSV后24 h之內Lv-SP基因在試驗組和對照組的表達均沒有明顯變化，但在感染后48.0 h和72.0 h，Lv-SP基因的表達量均有極顯著上調趨勢(P<0.01)(圖5)。由此推測Lv-SP基因可能在病毒感染晚期參與了應答WSSV的免疫防御反應。

3 結論與討論

在無脊椎動物中，含clip結構域的絲氨酸蛋白酶家族成員在胚胎發育和防御反應的信號級聯反應中都發揮著重要作用，目前對于絲氨酸蛋白酶在節肢動物中的作用機理報道還比較少。已有研究表明絲氨酸蛋白酶中clip結構域都含有6個保守的半胱氨酸，可以形成3個二硫鍵，在該研究中，克隆得到的Lv-SP基因編碼的氨基酸具有一個典型的信號肽結構，表明它在胞外執行功能，其氨基端的clip結構域含有6個保守的半胱氨酸，可以形成3個二硫鍵，預測形成的3個二硫鍵在穩定蛋白結構中可能發揮一定的作用，clip結構域可能提供了一個用于蛋白酶和其上游激活劑、下游蛋白底物或調節酶活力的輔因子相互作用的位點，使得在局部損傷和感染源的部位可以形成酶復合物。利用在線分析軟件SMART預測：Lv-SP的C端含有的Tryp-SPc結構域中，其催化三聯體是由His、Asp和Ser這3個氨基酸形成的，該結構域主要執行著消化和催化的功能。該研究獲得的Lv-SP可能屬于絲氨酸蛋白酶基因家族中的新成員。將Lv-SP蛋白序列在NCBI中進行Blast P比對，結果發現：該蛋白與其他物種的SP蛋白大致有40%～80%的相似度，在蝦類中相似度都為60%以上，并且均具有較保守的clip結構域和SP結構域(Tryp-SPc)。之前有研究顯示，普通的SP家族成員通常僅具有消化的功能，而含有clip結構域的SP主要參與免疫應答過程。Lv-SP與其他對蝦SP和已報道的凡納濱對蝦Lv-SP2在氨基酸序列上的差異，表明它們在特征和功能上可能同樣存在著顯著區別，該研究中的Lv-SP基因可能在免疫調控過程中發揮著不可替代的重要作用。

注：Lv SP2(凡納濱對蝦AFW98996.1)；Fc SP(中國明對蝦，AFW98989.1)；Es c-SP(中華絨螯蟹，AKN46053.1)；Pm c-SP(斑節對蝦，ACP19561.1)；Ha SP(端足蟲，XP_018023883.1)；Sp SP(擬穴青蟹，AUC65357.1)；Ag SP(按蚊，AAD38334.1)；Ad c-SP(大劣按蚊，ABE97918.1)；Pt c-SP(三疣梭子蟹，AFA42362.1)；Dm SP(果蠅，XP_017144359.1)；At SPH(小蜂窩甲蟲，XP_019880096.1)Note:Lv SP2 (Litopenaeus vannamei,AFW98996.1);Fc SP (Fenneropenaeus chinensis,AFW98989.1);Es c-SP (Eriocheir sinensis,AKN46053.1);Pm c-SP (Penaeus monodon,ACP19561.1);Ha SP (Hyalella azteca,XP_018023883.1);Sp SP (Scylla paramamosain,AUC65357.1);Ag SP (Anopheles gambiae,AAD38334.1);Ad c-SP (Anopheles dirus,ABE97918.1);Pt c-SP (Portunus trituberculatus,AFA42362.1);Dm SP (Drosophila miranda,XP_017144359.1);At SPH (Aethina tumida,XP_019880096.1)圖2 凡納濱對蝦Lv-SP與其他物種氨基酸序列多重比對Fig.2 Multi-alignment of Lv-SP with other SPs from different species

Lv-SP基因的組織表達特征分析能為預測其基因功能提供有價值的參考。Lv-SP基因在凡納濱對蝦中具有一定的組織表達特異性，在血細胞和鰓組織中表達量較高，而在心中表達量最低，血細胞和鰓都是重要的免疫器官或組織，鰓在對蝦中作為病原微生物的過濾器，是一個非常重要的免疫防御器官，這種器官上明顯的表達差異也許暗示著某種功能上的差異，Lv-SP基因在其中的高表達可能與宿主自身的免疫防御作用有關[18-20]，組織表達特征也間接表明了其在對蝦免疫調控過程中的作用。

圖3 凡納濱對蝦Lv-SP與其他物種SP的進化發生分析Fig.3 Phelogenetic analysis of the Lv-SP with other SPs from different species

圖4 凡納濱對蝦Lv-SP基因組織表達分析Fig.4 Expression analysis of Lv-SP gene in different tissues

圖5 WSSV感染后凡納濱對蝦血細胞Lv-SP基因的相對表達量Fig.5 Relative expression of Lv-SP gene after WSSV challenge in hemocytes

甲殼動物缺乏獲得性免疫系統，只能依靠自身天然免疫系統來抵抗外界各種病原體的入侵。對蝦WSSV是一種死亡率極高的病毒，實驗室條件下人工感染48.0 h內就會出現較高的死亡率。探討對蝦關鍵免疫基因應答WSSV侵染的表達變化特征，將有助于研究該基因在抗病毒免疫應答過程中的作用。天津師范大學水生生物學研究室前期轉錄組分析結果顯示Lv-SP基因具有較靈敏的應答病毒侵染的特征，該研究利用qPCR技術，以WSSV感染后具有較穩定表達水平的磷酸丙糖異構酶基因(TPI)作為內參基因，進一步在凡納濱對蝦活體感染WSSV后不同時期精確分析了其血細胞中Lv-SP基因的表達變化特征。研究結果表明病毒感染的早期和中期，該基因對病原的刺激沒有顯著應答變化，但在病毒感染晚期(48.0 h和72.0 h)，Lv-SP呈現極顯著上調表達(P<0.01)，該基因在對蝦血細胞中呈組成型表達，WSSV可以在一定范圍內誘導其轉錄水平的增強，Lv-SP可能通過上調自身表達，調控其所在的酚氧化酶激活途徑，進而參與到作用于病原的防御應答過程。

該研究克隆了凡納濱對蝦血細胞中的Lv-SP基因，探討了其序列及保守性特點，分析了其組織分布特征以及應答病毒侵染的表達變化模式。作為一種分布較為廣泛的蛋白，它在免疫過程中的諸多應答和級聯反應中可能具有重要功能，未來可進一步探討其精細的調節作用及在進化上的意義。

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