頭孢喹肟對胸膜肺炎放線桿菌的藥動/藥效學研究

張尤貞，顏秀梅，湯春蓮，李 琿，蔡一杰，許曉靖，吳 勛

(1.安徽省獸藥飼料監察所，安徽合肥 230091；2.安徽華澳生物技術有限公司，安徽合肥 230001)

目前，抗生素耐藥性的產生已嚴重威脅人類和動物的健康。一些觀點認為，抗生素的不規范使用(包括不合理的劑量、給藥途徑、給藥間隔等)，是導致細菌耐藥性產生的主要原因。因此，為了設計更合理的給藥方案，筆者將藥動學與藥效學數據進行整合，以期在提高療效的同時，減少耐藥菌株的產生。

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)是豬細菌性肺炎的一種重要病原菌，能夠引起豬的胸膜肺炎，是豬的一種嚴重的呼吸系統傳染病。病豬呈現發熱(可高達42 ℃)，呼吸困難，剖檢時可發現纖維素性胸膜肺炎，多感染肺部兩側，65%的肺尾葉感染嚴重，發病率達到2%～10%，致死率約10%[1]。耐過豬可以攜帶病原持續幾個月)[2]，感染后仍保持健康的動物就成為亞臨床病原攜帶者。一旦暴發該病,推薦盡快采用抗生素治療方法，早期及時治療是提高療效的重要條件。頭孢類、四環素類等抗生素都可用于臨床治療[3]。

頭孢喹肟是第4代頭孢菌素類抗生素，也是獸醫專用藥，目前已被用于治療由嗜血桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌等引起的呼吸道疾病以及由大腸桿菌和鏈球菌引起的乳房炎等疾病。目前，頭孢喹肟已在兔[4]、豬[5]等動物體內進行藥動學試驗。然而，關于頭孢喹肟對胸膜肺炎放線桿菌的半體內藥動藥效學研究鮮見報道。

PK/PD同步模型可以反映藥物濃度與殺菌效應之間的關系，能反映給藥后出現的時間-濃度-效應過程，真實模擬宿主、藥物以及細菌三者的動態相互變化關系。PK/PD模型[6]可大致分為體外PK/PD模型、半體內PK/PD模型、體內PK/PD模型3種。筆者利用半體內PK/PD同步模型，研究頭孢喹肟在動物體內的動力學過程和藥動學參數，旨在為治療由胸膜肺炎放線桿菌引起的呼吸道疾病提供合理的治療方案并減少臨床上耐藥菌的出現。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑硫酸頭孢喹肟注射液(2.5% Cobacton)，批號A621B01，購自英特威國際有限公司；頭孢喹肟對照品，含量80.9%，批號k0321205，購自中國獸醫藥品監察所；乙腈，HPLC級，含量≥99.9%，購自美國Fisher公司；甲酸，HPLC級，含量≥99.9%，購自美國Fisher公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養基Tryptic Soy Broth (TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基Tryptic Soy Agar (TSA)、新生牛血清和NAD氧化輔酶I均購自于國產生化試劑公司。

1.2試驗動物及試驗菌株

1.2.1試驗動物及其飼養管理。健康雜種豬(長白×大白×杜洛克)10頭，體質量25～30 kg，購自安徽省某種豬場。整個試驗期間，全部豬只自由飲水和采食，飼料為不含任何抗菌藥物的全價日糧。

1.2.2試驗菌株。胸膜肺炎放線桿菌來自臨床分離菌株(生物I型中的1型)，保存于大豆卵磷脂肉湯(含5%NAD)中。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213，購自中國獸醫藥品監察所。

1.3菌液的復蘇和制備將冷凍保存的多殺性巴氏桿菌接種到含5%新生牛血清的TSB肉湯培養基中，37 ℃搖床過夜培養，復蘇后的細菌劃線接種在含5%NAD的瓊脂培養基上，傳代培養5代，待細菌活力完全恢復后，再取單個菌落接種于含5%NAD的TSB肉湯培養基中擴菌培養，以獲取對數生長期的細菌。

1.4胸膜肺炎放線桿菌在肉湯培養基和血清中的最小抑菌濃度(MIC)的測定采用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)，具體試驗步驟參考CLSI。先將頭孢喹肟儲備液(1 280 μg/mL)用含5%NAD的TSB肉湯培養基和血清在10 mL無菌玻璃管中倍比稀釋成試驗所需的工作液。然后，再將稀釋好的工作液與處于對數期的菌懸液按照1∶1的體積比加入96孔板中，使96孔板中的菌液終濃度為5×105CFU/mL左右。同時，在96孔板上設置陽性對照孔(只含菌液，不含藥物)和陰性對照孔(只含培養基，不含菌液)，置于35 ℃恒溫培養箱中培養16～24 h，讀取結果。試驗重復3次，藥敏結果根據美國臨床實驗室標準化研究所CLSI標準進行判定。

1.5頭孢喹肟在血清中的靜態殺菌動力學曲線取1 mL空白血清稀釋的抗菌藥液，將處于對數生長期的細菌原液用空白血清稀釋到1×106CFU/mL后，取1 mL加到已知濃度抗菌藥的TSB肉湯和血清中，制得藥物濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 MIC和菌液終濃度約為5×107CFU/mL。置于37 ℃恒溫培養箱中培養，然后分別在孵育0、2、4、6、8、12和24 h后進行菌落計數。

1.6給藥和采樣5頭健康豬采用靜脈注射1 mg/kg的頭孢喹肟，5頭健康豬肌內注射1 mg/kg頭孢喹肟，在給藥前和給藥后5、15、30、45 min及1、2、3、4、6、8、12、24 h采集前腔靜脈血樣5 mL置于不含抗凝劑的塑料離心管中，室溫靜置30 min并避免陽光照射，隨后在4 ℃冰箱中放置2 h，以加速血塊凝縮，然后在4 ℃下4 000 r/min 離心10 min，分離血清。血清樣品分裝成2份，保存于-80 ℃下，一份用于藥物濃度檢測，另一份用于藥效學試驗。

1.7頭孢喹肟對胸膜肺炎放線桿菌的半體內藥效學研究將采集的空白血清和給藥后不同時段采集的樣品解凍后，使用孔徑0.22 μm的滅菌針式濾器過濾除菌，取適量除菌血清加入對數期的胸膜肺炎放線桿菌懸液，使血清樣品中胸膜肺炎放線桿菌的最終濁度為5×106CFU/mL左右，置于37 ℃恒溫培養箱中培養，分別于培養后0、2、4、6、8、12和24 h，采用平板菌落計數確定血清中活菌數。

1.8數據處理藥動學數據采用WinNonlin 5.2藥動學軟件(Pharsight Corporation，Mountain view，CA，USA)進行分析。組織液中藥物濃度-時間數據采用非房室模型進行處理，用梯形積分法計算藥時曲線下面積(AUC)；每次給藥后的藥物峰濃度(Cmax)從擬合出的藥時曲線中直接讀取；藥物濃度大于MIC的時間占給藥間隔的百分比，是通過結合MIC對組織液中藥物濃度進行分析后計算得到的。

以細菌變化量(E)為縱坐標，分別以PK/PD指數%T>MIC、Cmax/MIC及AUC/MIC為橫坐標，選用WinNonlin中合適的藥效學模型對3組數據進行擬合后，根據相關性得到用于預測抗菌效應的最佳PK/PD指數。

運用WinNonlin軟件中的抑制性SigmoidEmax模型對頭孢喹肟的抗菌效應與PK/PD指數的關系進行分析，模型方程式為：

(1)

式(1)中，E為抗菌效應，是24 h內細菌數量的變化值，即△lgCFU/mL；Emax為不含藥對照組中細菌量的變化值；E0為藥物與細菌作用24 h，藥物產生最大抗菌效應時的細菌變化量；Ce為PK/PD指數，包括%T>MIC、AUC/MIC和Cmax/MIC；EC50為藥物產生最大抗菌效應的50%所需的PK/PD指數值；N為Hill系數，表示PK/PD指數作用的藥效曲線的斜率。

臨床給藥劑量可以整合豬體內藥動學參數和體外抗菌試驗的結果，并結合抑制型SigmoidEmax模型擬合的 Ex-vivo AUC0-24/MIC 值，獲得不同抗菌效果需要的日給藥劑量，計算公式[7]如下：

(2)

式(2)中，Dose(per day)為日給藥劑量；(AUC/MIC)breakpoint為產生不同抗菌效應所需的 Ex-vivo AUC/MIC 臨界點；MIC90為抑制受試細菌群體90%的菌株所需的 MIC；CLper hour為給藥后每小時的體清除率；fu為豬血清中的游離藥物分數；F為頭孢喹肟的絕對生物利用度。

2 結果與分析

2.1胸膜肺炎放線桿菌在肉湯和血清中的MIC和MBC根據美國臨床實驗室標準化研究所CLSI標準，可知頭孢喹肟對胸膜肺炎放線桿菌在肉湯和血清中的MIC值均為 0.02 μg/mL，MBC值均為0.032 μg/mL。

2.2靜脈注射和肌內注射給藥后頭孢喹肟在豬體內的藥物濃度豬單劑量(1 mg/kg )靜脈注射和肌內注射給藥后，頭孢喹肟在豬血清的藥物濃度-時間數據采用WinNolin 5.2.1 藥動學軟件提供的非房室模型進行處理。藥物濃度-時間曲線見圖1。從圖1可以看出，組織液中藥物濃度在0.5 h左右達到峰值，在體內的消除半衰期更長。

圖1 單劑量(1 mg/kg)靜脈注射和肌內注射頭孢喹肟后豬的藥時曲線Fig.1 The drug concentration-time curve of pig after single dose (1 mg/kg)of cefquinome by intravenous injection and intramuscular injection

2.3頭孢喹肟在體內的藥動學參數通過靜脈注射和肌內注射頭孢喹肟(1 mg/kg)所測得的藥動學數據分別符合二室模型和一級吸收二室模型，具體藥動學參數見表1。血清中藥物濃度與時間的關系式如下：C=Ae-αt+Be-βt，C=Ae-αt+Be-βt-(A+B)e-kat。

表1靜脈注射和肌內注射頭孢喹肟(1mg/kg)后血清中的藥動學參數

Table1Thepharmacokineticparametersintheserumaftersingledose(1mg/kg)ofcefquinomebyintravenousinjectionandintramuscularinjection

注射方式InjectionmethodsA∥mg/Lα∥h-1B∥mg/Lβ∥h-1Ka∥h-1V∥L/kg靜脈注射Intravenousinjection3．61±0．589．25±1．272．17±0．380．62±0．080．25±0．09肌內注射Intramuscularinjection1．83±0．511．21±0．430．83±0．210．42±0．0913．21±2．780．46±0．07注射方式Injectionmethodst1/2α∥/ht1/2β∥ht1/2Ka∥hK10∥h-1K12∥h-1K21∥h-1靜脈注射Intravenousinjection0．16±0．041．52±0．433．35±0．874．87±1．533．23±0．81肌內注射Intramuscularinjection0．78±0．252．76±0．460．08±0．020．58±0．210．55±0．090．21±0．04注射方式InjectionmethodsCL∥L/(kg·h)Cmax∥μg/mLTmax∥hAUC0～24∥(μg·h)/mLF∥%靜脈注射Intravenousinjection0．28±0．07肌內注射Intramuscularinjection0．24±0．030．237±0．0560．31±0．083．8±0．68104．57±11．28

2.4頭孢喹肟在血清中的靜態殺菌動力學曲線從圖2可以看出，頭孢喹肟對胸膜肺炎放線桿菌具有明顯的抗菌活性，并且隨著藥物濃度的增加，頭孢喹肟的抗菌效應增強。在血清中，經過2 h的培養，菌液濃度已呈梯度性變化，0.5 MIC時無明顯的抑菌效應，1.0 MIC時對細菌的生長有抑制作用，當濃度大于2.0 MIC時呈現殺菌效應，并且濃度越大，殺菌速率越快；當濃度超過4.0 MIC時，細菌數量下降幅度不大。

圖2 頭孢喹肟在血清中對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌效應Fig.2 The antibacterial effect of cefquinome in the serum on Actinobacillus pleuropneumoniae in vitro

2.5半體內模型中頭孢喹肟對胸膜肺炎放線桿菌的抗菌效應肌內注射和靜脈注射頭孢喹肟(1 mg/kg)后，在11個時間點采集的豬血清中頭孢喹肟對胸膜肺炎放線桿菌的半體內抗菌效應分別見圖3和圖4。從圖3和圖4可以看出，肌肉注射后，在0～6 h內采集的血清樣品能夠達到清除效應作用(細菌濃度下降1×104CFU/mL)；8 h采集的血清樣品，可達到殺菌效應(細菌濃度下降1×103CFU/mL)；12 h后細菌數量低于檢測限。12 h采集的血清樣品可達到抑菌作用。靜注后，在0～8 h內采集的血清樣品均具有清除效應。12 h后，細菌數量低于檢測限。12 h采集的血清樣品，可達到抑菌作用。

圖3 肌內注射頭孢喹肟(1 mg/kg)后體外24 h殺菌曲線Fig.3 The bactericidal curve in vitro after intramuscular injection of 1 mg/kg cefquinome 24 h

圖4 靜脈注射頭孢喹肟(1 mg/kg)后體外24 h殺菌曲線Fig.4 The bactericidal curve in vitro after intravenous injection of 1 mg/kg cefquinome 24 h

2.6頭孢喹肟對胸膜肺炎放線桿菌的PK/PD關系頭孢喹肟對胸膜肺炎放線桿菌的PK/PD指數之間的關系見圖5。由圖5可知，血清中PK/PD指數AUC0-24/MIC和Cmax/MIC與細菌變化量E的擬合效果均良好。由相關系數R2可知，AUC0-24/MIC (R2=0.9967)是預測頭孢喹肟的抗菌效應最合適的PK/PD指數。分別產生抑菌、抗菌和清除的效應時，相對應的AUC0-24/MIC分別為116.0、175.5和218.5。

圖5 PK/PD參數與細菌變化量(E)的關系Fig.5 The relationship between PK/PD parameters and variable quantity of bacteria

3 討論與結論

目前，頭孢喹肟的藥動學數據已經在豬、牛[8]等動物體內進行了研究。該試驗結果表明，肌內注射硫酸頭孢喹肟符合一級吸收二室模型，其主要的藥動學參數如下：血藥達峰時間(Tmax)為0.31 h，峰濃度(Cmax)為0.237 μg/mL，t1/2β為2.76 h，AUC0-24為3.8(μg·h)/mL 與楊大偉等[9]研究結果相一致。但是，該試驗測得的藥動學數據與劉利鋒等[10]的數據存在差異，這可能是由于動物的大小或者頭孢喹肟的生產廠家的工藝的不同造成的。

測定在不同培養介質的條件下，藥物對細菌體外的MIC和MBC值，對研究藥動/藥效學同步模型具有重要的意義。Shan等[11]研究發現在不同的基質中，能夠引起MIC和MBC不一致，結果表明頭孢喹肟在血清、組織液和炎癥滲出液對多殺性巴氏桿菌的MIC和MBC比MH肉湯中高 3 倍左右。Zhang等[12]研究發現頭孢喹肟在MHB和血清中對大腸桿菌的MIC值分別為 0.030和0.032 μg/mL，MBC值分別為0.060和0.064 μg/mL，基質效應無明顯差異。該試驗通過測定頭孢喹肟對胸膜肺炎放線桿菌在肉湯和血清中的MIC和MBC，結果發現無論在肉湯還是血清中，頭孢喹肟對胸膜肺炎放線桿菌均具有相同的抗菌活性。這些研究結果對于治療胸膜肺炎放線桿菌有著一定的指導作用。但是，如果測定體內的MIC和MBC,可能會對臨床具有更合理的指導作用。

半體內PK/PD模型屬于PK/PD 研究的一種有效方法，可為臨床疾病的治療提供一定的合理建議。頭孢喹肟屬于時間依賴性藥物，其最有預測效果的 PK/PD 的參數是%T>MIC[13]，但是由于在半體內研究中藥物的濃度是恒定不變的，因此，獲得%T>MIC的意義不大。因此 選擇測定AUC0-24/MIC 來擬合數據。該試驗結果表明，當AUC0-24/MIC達到116.0、175.5和218.5時，細菌變化量E分別下降2 lgCFU/mL、3 lgCFU/mL和4 lgCFU/mL。參考上述公式，細菌變化量E下降2 lg CFU/mL、3 lg CFU/mL和4 lg CFU/mL所需每天的給藥劑量分別為0.56、0.84和1.0 mg/kg。因此，當頸部肌內注射硫酸頭孢喹肟(1.0 mg/kg)，可達到清除細菌的效果。

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