響應面法優化三百棒多糖提取工藝

田 瑞，夏 燕，馮 佳，楊年安，向 陽，陳安平，袁 林

(湖北民族學院風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北恩施 445000)

三百棒(ToddaliaasiaticdLam.)又名見血飛、大救駕等，為蕓香科飛龍掌血屬植物的根和根皮，主產于湖南、湖北、貴州、四川等地，非洲東部及亞洲東南部和南部均有分布。傳統醫學認為，三百棒具有活血散瘀、舒筋通絡、消腫止痛的作用，常用于治療跌打損傷、風濕痹痛、胃痛及痛經[1]?，F代醫學研究表明，三百棒具有治療胃腸炎、抗腫瘤、抗炎鎮痛及抑菌等作用[2-5]。

關于三百棒多糖的研究較少[6-7]。筆者采用響應面分析方法對三百棒多糖的提取工藝進行優化，旨在為三百棒多糖的提取工藝研究提供理論依據，同時對三百棒多糖的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料三百棒采于湖北省恩施州咸豐縣，經湖北民族學院附屬民大醫院制劑室張國安主任藥師鑒定為飛龍掌血(ToddaliaasiaticaLam.)。蒽酮、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸均為分析純。

1.2儀器BILON-W420 數顯三用恒溫水箱，西安德派生物技術有限公司； 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；離心機，eppendorf公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；冷凍干燥機(GOID-S2M),上海歐蒙實業有限公司。

1.3三百棒多糖的提取稱取一定質量的三百棒干粉，加入適量的水，攪拌均勻，在一定溫度下浸提一定時間，然后離心(3 000 r/min，10 min)，濃縮，醇沉4 ℃過夜，離心(3 000 r/min,10 min)，Sevage法脫蛋白[8]，然后濃縮揮發掉有機溶劑，真空冷凍干燥。

1.4單因素試驗設定料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(g∶mL)]、提取溫度(40、60、80、100 ℃)、提取時間(2.0、3.0、4.0、5.0 h)、提取次數(2、3、4、5次)為自變量進行單因素試驗。

1.5三百棒多糖含量的測定

1.5.1標準曲線的制作。采用蒽酮硫酸法[9]測定三百棒多糖含量。準確稱取干燥恒重的葡萄糖標準品100 mg，定容于200 mL容量瓶，即得0.5 mg/mL葡萄糖標準溶液。分別吸取0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mL標準葡萄糖溶液，用蒸餾水補至2.0 mL，以2.0 mL蒸餾水為空白，然后各自加入0.5及5.0 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴1.0 min，630 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得標準曲線。標準曲線的回歸方程為Y=0.008 0X+0.000 8,R2=0.999 2。

1.5.2樣品多糖含量的測定。脫蛋白后，取5.0 mL定容于10.0 mL，量取0.5 mL，用蒸餾水補至2.0 mL，按照“1.5.1”的步驟測定吸光度。以標準曲線計算三百棒多糖含量。

1.6三百棒多糖提取的中心組合試驗[10-11]在單因素試驗的基礎上，采用Box-Benhnken試驗設計，用響應面軟件Design Expert 8.05b分析料液比、提取溫度、提取時間、提取次數4因素中影響較大的3水平，分別以-1、0、1表示，具體設計見表1。

2 結果與分析

2.1單因素試驗結果由圖1可知，隨著料液比的增加，三百棒多糖的得率快速增加，當料液比達1∶15后，三百棒多糖的得率增加緩慢，可見增大料液比有利于三百棒多糖的提取，但增大到一定程度后，三百棒多糖的得率基本趨于穩定。

表1 Box-Bennhnken試驗設計因素與水平

圖1 料液比對三百棒多糖提取率的影響Fig.1 Effects of solid liquid ratio on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.polysaccharides

由圖2可知，隨著溫度增加，多糖的得率快速增加，溫度達80 ℃后稍有下降，可能是由于高溫條件下一部分多糖發生水解[12]，導致多糖損失，另外溫度過高會使許多雜質含量增加，造成三百棒多糖的分離困難。由此可知，三百棒多糖的提取溫度以80 ℃最好。

圖2 提取溫度對三百棒多糖提取率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.polysaccharides

由圖3可知，在一定提取時間內，三百棒多糖的得率隨著時間的增加而增加，在4.0 h時達到最高，當提取時間達5.0 h時，多糖得率稍有下降，可能是因為時間過長導致三百棒多糖部分降解[13]，由此可知，三百棒多糖的提取時間以4 h最好。

由圖4可知，三百棒多糖的得率隨著提取次數的增加逐漸增加，但當提取次數達3次后，多糖的得率趨于穩定，并稍有下降，可見三百棒多糖的提取次數宜選擇3次。

圖3 提取時間對三百棒多糖提取率的影響Fig.3 Effects of extraction times on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.’s polysaccharides(TALP)

圖4 提取次數對三百棒多糖提取率的影響Fig.4 Effects of extraction times on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.’s polysaccharides

2.2響應面試驗結果結合單因素試驗結果，采用Box-Benhnken中心組合試驗法，選取料液比、提取溫度、提取時間、提取次數因素中影響較大的4因素，進行4因素3水平的中心組合試驗，以三百棒多糖得率為響應值，通過響應面分析優化三百棒多糖的提取工藝條件(表2)。

表2 Box-Benhnken試驗設計及結果

利用Design Expert 8.05b軟件對試驗數據進行二次多元回歸擬合，以料液比(X1)、提取溫度(X2)、提取時間(X3)、提取次數(X4)為自變量，三百棒多糖提取率(Y)為響應值。其回歸方程：

Y=4.540+0.140X1+0.440X2+0.170X3+0.400X4+0.190X1X2+0.070X1X3+0.062X1X4+0.033X2X3+0.057X2X4-0.015X3X4-0.200X12-0.530X22-0.150X32-0.290X42

利用Design Expert 8.05b軟件對響應面結果進行回歸擬合分析，并對回歸方程的系數進行顯著性檢驗。

2.3最佳條件優化及驗證試驗根據回歸模型的分析結果，得到三百棒多糖提取的最佳工藝條件：料液比1∶14.87，提取溫度93.16 ℃，提取時間3.85 h，提取次數3.83次，在該條件下三百棒多糖提取率的預測值為4.99%?？紤]到實際操作情況，將最佳提取工藝修正為料液比1∶15，提取溫度93 ℃，提取時間4 h，提取次數3次，在此條件下，三百棒多糖提取率為4.75%。預測值和實際值很接近，偏差較小，因此此響應面法優化得到的模型參數準確可靠(圖5)。

3 結論

該試驗通過對料液比、提取溫度、提取時間、提取次數4個因素進行響應面分析，并由回歸模型的方差分析結果可知4個因素的影響均顯著。三百棒多糖的最佳提取工藝條件：料液比1∶15，提取溫度93 ℃，提取時間4 h，提取次數3次。在此條件下得到的多糖提取率為4.75%，接近預測值4.99%，表明采用響應面法優化三百棒多糖的提取工藝準確可靠，科學可行，具有很好的參考價值。

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