五味子油超聲輔助提取工藝優化及其護肝作用

王小寧 - 郝 晶 劉子晨 - 閆夢茹 - 張存勞 -

(西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021)

肝損傷是常見的臨床疾病之一。中國是肝病大國，多種急慢性肝病在中國均有較廣分布，并且發病率呈逐年上升的趨勢[1]。近年來，從植物中提取天然性成分護肝成為研究的熱點[2]。五味子為木蘭科植物五味子或華中五味子的干燥果實，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功能[3]。研究[4-5]表明，五味子對化學性、藥物性、酒精性等不同類型的肝損傷具有不同程度的保護作用。白慧媛等[6]研究了五味子對氯氮平致小鼠肝損傷的保護作用，結果表明，五味子能減輕肝細胞的損傷，降低由氯氮平引起的AST和ALT增高。張錦楠等[7]的研究表明五味子果汁可以顯著提高大鼠肝微粒體CYP450水平，增強肝臟代謝功能。汪麗君等[8]研究表明，五味子中的木脂素成分(包括五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等)具有改善肝功能、減輕肝細胞脂質過氧化損傷的作用，是保肝作用的主要物質基礎。丁傳波等[9]從五味子藤莖中提取的木脂素能夠有效緩解CCl4造成的小鼠急性肝損傷，其高劑量組的改善作用與聯苯雙酯相近。宋影影等[10]對五味子籽壓榨油的成分及對酒精肝損傷的保護作用進行了研究，但關于五味子種籽油的提取工藝及種籽油對急性肝損傷的保護作用鮮有報道。本試驗以五味子種籽為原料，用單因素和正交試驗篩選最優種籽油的超聲輔助提取工藝，高效液相色譜法分析其中木脂素成分的含量，并考察五味子種籽油對小鼠急性肝損傷的保護作用，為五味子的進一步開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

五味子：北五味子，陜西鎮安瑞琪藥材有限公司；

昆明白小鼠：SPF級，中國人民解放軍第四軍醫大學實驗動物中心；

五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對照品：純度99.46%，成都曼斯特生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；

乙酸乙酯、無水乙醇、正己烷、石油醚、四氯化碳：分析純，天津富宇精細化工有限公司；

花生油：壓榨一級，山東魯花集團有限公司；

GSH、MDA、SOD試劑盒：南京建成科技有限公司；

肝泰樂：每片100 mg，北京太洋藥業有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

萬分之一電子分析天平：ALC-210.4型， 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

超聲波清洗器：KQ5200E型，昆山市超聲儀器有限公司；

低速大容量離心機：TDL-5-A型，上海安亭科學儀器制造廠；

高效液相色譜儀：Agilent Tech-1260型，安捷倫科技有限公司；

旋轉蒸發儀：R201L型，上海申生科技有限公司；

酶標儀：Multiskan Go型，賽默飛世爾科技有限公司；

循環水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限公司；

紫外可見分光光度儀：CARY-60型，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 五味子籽仁油超聲輔助提取工藝的優化

1.2.1 五味子種籽的前處理 將干燥的五味子果實放入80 ℃ 的熱水中浸泡2 h，搓出種籽去除果肉并清洗干凈，陰干，將適量五味子種籽粉碎過16目篩，備用。

1.2.2 五味子種籽油的提取及提油率的測定 精密稱取粉碎后的已稱重五味子種籽(記為m)加入100 mL錐形瓶中，加入提取溶劑，超聲一定時間。取一已稱重(記為m1)的干燥潔凈的圓底燒瓶，將提取得到的溶液抽濾后轉移至圓底燒瓶中，旋轉蒸發除去溶劑得五味子種籽油，并將燒瓶和油稱重，記為m2，提油率按式(1)計算：

(1)

式中：

ER——提油率，%；

m1——燒瓶和油總質量， g；

m2——燒瓶質量， g；

m——五味子種籽的質量，g。

1.2.3 提取工藝的優化

(1) 單因素試驗：以提油率為指標，依次考察溶劑種類(無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、正己烷)、料液比[1∶10，1∶12，1∶15，1∶18，1∶20 (g/mL)]、提取時間(0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h)、提取溫度(20，30，40，50，60 ℃)、超聲功率(40,60,80,100,120 W)5個因素對提油率的影響。當選定某一因素進行單因素試驗時，其余各個因素的條件為：提取溶劑為正己烷，料液比1∶15 (g/mL)，提取時間2 h，提取溫度30 ℃，超聲功率80 W。

(2) 正交試驗設計：根據單因素試驗的結果，以提油率為考察指標，采用四因素三水平的正交試驗優化提取工藝。

1.2.4 五味子種籽油中木脂素含量的測定 采用高效液相色譜法測定木脂素含量，測定方法根據文獻[11]修改如下：繪制標準曲線：分別制備57.00 μg/mL的五味子甲素對照液、26.25 μg/mL的五味子乙素對照液、4.80 μg/mL的五味子醇甲對照液，各精密吸取上述3份對照品液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0 mL 于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，得一系列濃度的對照品溶液。吸取上述溶液20 μL注入高效液相色譜儀，色譜條件為：Diamond C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相甲醇-水(體積比為80∶20)；流速1.0 mL/min；檢測波長254 nm；進樣量20 μL；柱溫30 ℃。記錄色譜圖，進行線性回歸，計算樣品中木脂素的含量。

1.3 保肝作用及機制研究

1.3.1 試驗分組 昆明白小鼠48只，體重18～22 g，隨機分為6組，每組8只，雌雄各半。試驗分組：五味子種籽油高劑量組(五味子種籽油2 g/kg)、中劑量組(五味子種籽油1 g/kg)、低劑量組(五味子種籽油0.5 g/kg)、陽性藥物對照組(肝泰樂5.7 mg/mL)、肝損傷模型組以及正常對照組。

1.3.2 試藥的配制

(1) 0.2% CCl4花生油溶液的配制：精密量取CCl40.2 g于100 mL燒杯中，加花生油定容，得0.2% CCl4花生油溶液。

(2) 24 mg/mL肝泰樂混懸液的配制：取肝泰樂片劑20片(重量為1.427 g)，研成細粉。精密稱取肝泰樂粉末342.5 mg于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，用前充分搖勻，得濃度為5.7 mg/mL的藥物溶液。

(3) 五味子種籽油花生油溶液的配制：分別稱取五味子種籽油2.0，1.0，0.5 g于10 mL容量瓶中，加入花生油定容，搖勻，得濃度分別為200，100，50 mg/mL的五味子種籽油花生油溶液。

1.3.3 肝損傷模型的建立 在人工控制晝夜12 h，溫度20.3～23.1 ℃，壓差20 Pa(進風180 Pa，出風160 Pa)，相對濕度40%～60%的飼養條件下，先將小鼠進行1周的適應性喂養，然后進行連續7 d的給藥，于給藥的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液造肝損傷模型，灌喂量為第1、7天10 mL/kg，第4天為5 mL/kg。

1.3.4 給藥方案

(1) 五味子種籽油高、中、低劑量組給藥方法：分別每天灌喂200，100，50 mg/mL五味子種籽油花生油溶液，灌喂量為10 mL/kg，按10 mL/kg灌喂蒸餾水作為空白組，并于給藥的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液。

(2) 陽性藥物對照組給藥方法：每天灌喂24 mg/mL肝泰樂混懸液10 mL/kg，每次灌喂時充分搖勻，同時灌喂花生油10 mL/kg作為對照，并于給藥的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液。

(3) 肝損傷模型組：每天灌喂花生油10 mL/kg、蒸餾水10 mL/kg作對照，并于給藥的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液。

(4) 正常對照組：每天灌喂花生油10 mL/kg，蒸餾水10 mL/kg，并于給藥的第1、4、7天補灌其他組0.2% CCl4花生油溶液等量的花生油。

1.3.5 組織勻漿制備 最后一次灌喂CCl4，16 h后將小鼠斷頸處死取出肝臟，于0.9%生理鹽水中清洗去除剩余血液，切一小部分稱重，按1∶9 (g/mL)比例加入生理鹽水，在冰水浴中勻漿，充分勻漿后轉移至離心管中5 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.3.6 谷胱甘肽(GSH)含量測定 采用微量酶標法。通過谷胱甘肽還原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，而GSH可以和生色底物DTNB反應產生黃色的TNB和GSSG[12]。于405 nm處測定吸收度，計算GSH含量。

1.3.7 丙二醛(MDA)含量測定 過氧化物脂質降解產物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色復合物，分光光度計532 nm處比色，計算MDA含量[12]。

1.3.8 超氧化歧化酶(SOD)活性測定 黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子，后者氧化羥氨形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現紫紅色，而SOD則抑制此反應，分光光度計550 nm處比色，計算SOD活性[13]。

1.3.9 肝臟病理檢測 將標本進行石蠟包埋，制成4 m石蠟切片。經二甲苯脫蠟及梯度乙醇復水后，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，再進行梯度乙醇脫水，脫水后將組織切片中的乙醇用二甲苯置換出來。最后滴加中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 提取工藝的優化結果

2.1.1 溶劑種類對五味子種籽油提取率的影響 圖1結果表明，以正己烷為溶劑時五味子種籽油的提取率最高，因此選定正己烷為提取溶劑進行后續研究。

圖1 溶劑種類對提油率的影響Figure 1 Effect of solvent types on extraction rate of seed oil

2.1.2 料液比對五味子種籽油提取率的影響 由圖2可知，當溶劑達到飽和量后，提油率不再上升，繼續增加溶劑量只會造成溶劑的浪費，因此，選定料液比為1∶15 (g/mL)進行后續研究。

圖2 料液比對提油率的影響Figure 2 Effect of the ratio of solid to liquid on extraction rate of seed oil

2.1.3 超聲功率對五味子種籽油提取率的影響 由圖3可知，隨著超聲功率的增大，提油率逐漸增大，但當超聲功率達到一定限度后，提油率下降。推測原因是超聲功率過大，使得很多無效成分被提出，這些成分對油可能具有吸附作用，使油難以被提出。選擇超聲功率80 W進行后續研究。

圖3 超聲功率對提油率的影響Figure 3 Effect of the ultrasonic power on extraction rate of seed oil

2.1.4 提取時間對五味子種籽油提取率的影響 由圖4可知，超聲時間對提油率影響較明顯，但當提取時間到達一定限度后，繼續延長提取時間提油率不再上升，因此選擇提取時間為2 h進行后續研究。

圖4 提取時間對提油率的影響Figure 4 Effect of the extraction time on extraction rate of seed oil

2.1.5 提取溫度對五味子種籽油提取率的影響 由圖5可知，在整個溫度范圍內，五味子種籽油的提取率變化不大，從提油率結果和實際應用角度考慮，選擇40 ℃為最優提取溫度。

圖5 提取溫度對提油率的影響Figure 5 Effect of the temperature on extraction rate of seed oil

2.1.6 正交試驗 根據單因素篩選得到的最優條件，以料液比、超聲功率、提取時間、提取溫度為因素，建立四因素三水平的正交試驗，因素水平表見表1，正交試驗及結果見表2，方差分析表見表3。

由表2可知，影響超聲提取五味子種籽油提取效果的因素排序為B>A>D>C；由方差分析結果可知，超聲功率對提油率具有顯著影響(P<0.05)；最佳的工藝條件為A3B3C2D3，即料液比1∶18 (g/mL)、超聲功率80 W、提取時間2 h、提取溫度50 ℃。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 正交試驗及結果Table 2 L9(34) orthogonal test and data processing

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.1.7 驗證實驗 精密稱取2 g同一批五味子種籽3份，分別置于3個錐形瓶中，按上述最優提取工藝，得到提油率分別為29.86%，30.0%，29.95%，平均提油率為29.94%，RSD值為0.25%，提取率高，工藝穩定。五味子種籽油中五味子甲素含量為4.00%，五味子乙素含量為1.95%，五味子醇甲含量為0.13%，與文獻[14]中報道的數據相比，木脂素總含量高于五味子果實，具有較高的商業開發價值。

2.2 護肝作用研究

2.2.1 五味子種籽油對小鼠肝組織GSH、SOD及MDA活性的影響 CCl4在肝細胞色素P450氧化酶作用下，生成CCl3·和Cl·，CCl3·導致的脂質過氧化過程，被認為是引發肝損傷的主要機制[15]。自由基過度累積會引起細胞膜完整性和功能的喪失。SOD和GSH-Px是組成生物體體內酶促防御體系重要的抗氧化酶，它們能有效地清除活性氧自由基并終止自由基鏈式反應[16]。當肝細胞受到自由基攻擊時，SOD、GSH會因過度消耗而逐漸減少。MDA是體內自由基攻擊脂質產生脂質過氧化物的代謝終產物，MDA水平的高低可以反映細胞氧化損傷的程度[17]。由表4可知，與空白對照組比較，肝損傷模型組小鼠肝組織GSH和SOD水平顯著降低(P<0.01)，MDA水平顯著升高(P<0.01)，表明CCl4肝損傷模型造模成功，小鼠肝臟抗氧化能力降低，氧化應激增加。與肝損傷模型組比較，五味子種籽油低、中、高劑量和肝泰樂保肝藥均可顯著降低肝組織MDA含量(P<0.01)，升高SOD和GSH水平(P<0.01)，提示五味子種籽油可顯著改善小鼠肝臟的氧化應激狀況，推測其保護作用的機制是通過清除氧自由基實現的。

2.2.2 五味子種籽油對小鼠肝臟病理形態的影響 由圖6可知，空白對照組肝組織結構正常，肝小葉結構完整，肝細胞條索排列規則，細胞形態正常，細胞質均勻紅染，細胞核清晰，未見明顯腫脹變性，枯否氏細胞分布均勾，未見周圍大量聚集[圖6(a)]。CCl4模型組肝小葉界限模糊，肝細胞索紊亂，肝細胞輪廓模糊，肝上皮細胞細胞核濃縮、溶解，有一些大片狀肝細胞壞死灶[圖6(b)]。陽性對照組肝細胞形態基本恢復正常[圖6(c)]，細胞輪廓較為清晰。低劑量組肝細胞形態較為正常，但仍有部分干細胞輪廓模糊，門管區仍能觀測到炎癥細胞浸潤[圖6(d)]；中、高劑量組大多數肝臟結構較CCl4模型組恢復明顯，肝小葉結構完整，細胞排列緊密，肝細胞形態基本接近于空白對照組，肝竇恢復正常，肝索呈放射狀排列[圖6(e)、(f)]。

表4 SOD、MDA、GSH含量測定結果?Table 4 Results of SOD, MDA, GSH content

? a. 與正常對照組相比，差異極顯著(P<0.01)；b. 與肝損傷模型組相比，差異顯著(P<0.05)；c. 與肝損傷模型組相比，差異極顯著(P<0.01)。

3 結論

采用單因素試驗及正交試驗對五味子種籽油的超聲提取工藝進行優化，得最佳提取工藝為：料液比1∶15 (g/mL)、超聲功率80 W，提取時間2 h，提取溫度50 ℃，驗證實驗表明工藝穩定，提油率高。HPLC法分析五味子種籽油中木脂素成分的含量，得五味子甲素含量為4.00%，五味子乙素含量為1.95%，五味子醇甲含量為0.13%。保肝試驗結果表明，五味子種籽油高、中、低劑量組均可顯著降低肝組織MDA含量(P<0.05或P<0.01)，升高SOD和GSH水平(P<0.01)，說明五味子種籽油可顯著改善小鼠肝臟的氧化應激狀況。HE染色結果顯示五味子種籽油可改善小鼠肝細胞水腫、壞死，修復肝損傷。與肝功能相關的血液生化學指標的變化及超聲輔助提取工藝的中試放大試驗還有待進一步研究。

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