LED藍(lán)光與檸檬酸對大腸桿菌的協(xié)同抗菌作用

俞建峰 - 夏曉露 - 崔政偉 - 陳 健 張楚唯 -

(1. 江南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品先進(jìn)制造裝備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

隨著消費(fèi)者食品安全意識的不斷提高，以及食品相關(guān)法律法規(guī)執(zhí)行力的逐步增強(qiáng)，食品安全和食品質(zhì)量正受到越來越多的關(guān)注。而在食品安全領(lǐng)域最讓消費(fèi)者關(guān)注的就是細(xì)菌、寄生蟲和病毒這類能夠引起食源性疾病的病原體[1-2]。滅菌是最有效的食品保鮮方法之一，已被廣泛地應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。如今，傳統(tǒng)的熱滅菌技術(shù)在食品工業(yè)中依然占主導(dǎo)地位，但也存在缺陷。為了克服熱滅菌的局限性，目前的研究重點(diǎn)在于開發(fā)新的滅菌技術(shù)[3]。不同的非熱滅菌技術(shù)(如超高壓[4]、超聲波[5]、高壓脈沖電場[6]、電子束輻照[7]等)都已被證實(shí)具有良好的滅菌效果。

近來，發(fā)光二極管(LED)技術(shù)成為微生物滅活方面的研究熱點(diǎn)。LED是一種可以在非常窄的波長光譜內(nèi)發(fā)光的半導(dǎo)體組件。與傳統(tǒng)的可見光源相比，其具備能耗低、耐用性高等優(yōu)點(diǎn)。此外，由于體積較小，LED可靈活應(yīng)用于現(xiàn)有系統(tǒng)[8-9]。如今，LED已廣泛應(yīng)用于光電、電子和醫(yī)療等領(lǐng)域。多項(xiàng)研究[10-11]表明，使用LED藍(lán)光處理懸浮狀態(tài)下食源性病原體，可使其降低多個(gè)數(shù)量級。

檸檬酸是一種動(dòng)植物體內(nèi)重要且常見的有機(jī)酸，安全無毒、無害，常在食品領(lǐng)域被作為食品添加劑和防腐劑使用[12]。檸檬酸能夠降低環(huán)境的pH，使氫離子在細(xì)胞內(nèi)不斷累積，從而改變細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，破壞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，故具備抑制細(xì)菌細(xì)胞生長和繁殖的功能[13-14]。

大腸桿菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)是一種常見的食源性致病菌，可產(chǎn)生志賀毒素，引起出血性腸炎、溶血性尿毒癥綜合征等[15]。疾病控制和預(yù)防中心(CDC)的報(bào)告稱，每年由大腸桿菌O157:H7引起的食源性感染約有73 000 例，其中有2%～7%為嚴(yán)重的溶血性尿毒癥綜合征[16]。大腸桿菌O157:H7的食源性致病爆發(fā)主要與受污染的食物(如新鮮蔬菜、酸性飲料和肉類等)有關(guān)[17]。目前，關(guān)于LED可見光抗菌的研究方向主要有可見光波長、不同的食物基質(zhì)和不同的食源性致病菌等，而針對LED藍(lán)光輻照強(qiáng)度與檸檬酸質(zhì)量濃度對大腸桿菌O157:H7的協(xié)同抗菌的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)主要研究不同輻照強(qiáng)度的LED藍(lán)光以及不同質(zhì)量濃度的檸檬酸與LED藍(lán)光協(xié)同作用對大腸桿菌O157:H7抗菌效果的影響，以期為食品加工生產(chǎn)和食品保鮮中大腸桿菌O157:H7的滅活提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌O157:H7 (EscherichiacoliO157:H7) 菌株：江南大學(xué)生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；

檸檬酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：1 g葡萄糖，15 g瓊脂，5 g胰蛋白胨，2.5 g酵母浸出粉，pH 7.2，溶于1 000 mL去離子水中，加熱煮沸溶解，錐形瓶分裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min；

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：10 g蛋白胨，3 g牛肉浸出粉，5 g氯化鈉，pH 7.2，溶于1 000 mL去離子水中，加熱煮沸溶解，錐形瓶分裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min；

精密電子分析天平：AR1140型，奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；

恒溫鼓風(fēng)烘干干燥箱：DHG-9076A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

超凈工作臺：SJ-CJ-2FD型，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌鍋：XFS-280型，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；

恒溫生化培養(yǎng)箱：SPX-200型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；

藍(lán)光LED燈：TDB-9型，深圳市我的照明燈飾有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化及懸菌液制備 將甘油管保藏的菌種從-20 ℃的冰箱中取出，放在超凈工作臺上，室溫融化，用滅菌后的接種環(huán)取1環(huán)菌液在固體瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h。挑取培養(yǎng)基上生長旺盛的單菌落，接種于液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩搖床培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)2～3次。將初始菌液10倍系列稀釋，并用平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)，然后計(jì)算其濃度?；罨玫木嘿A存于4 ℃的冰箱中，且時(shí)間不超過10 d。

1.2.2 LED光照系統(tǒng) 藍(lán)光LED燈具功率為9 W，光照直徑為90 mm。在光照試驗(yàn)中，光源與培養(yǎng)皿的間距分別為4.5，5.5，6.5 cm，其對應(yīng)輻照強(qiáng)度為141.4，85.8，26.7 mW/cm2。將安裝好的LED燈具固定于燈架上，且整個(gè)LED光源放置于含有內(nèi)接電源的恒溫控制培養(yǎng)箱中，LED光照系統(tǒng)截面示意圖見圖1。

1. 懸菌液 2. 燈架 3. 散熱板 4. 恒溫生化培養(yǎng)箱 5. 藍(lán)光LED 6. 藍(lán)光 7. 培養(yǎng)皿 8. 聚四氟乙烯板

圖1 LED光照系統(tǒng)截面示意圖

Figure 1 The cross sectional diagram of the LED illumination system

1.2.3 LED藍(lán)光對大腸桿菌O157:H7的抗菌試驗(yàn) 為模擬超市貨架低溫及室溫，將試驗(yàn)溫度設(shè)計(jì)為12，25 ℃。在超凈工作臺上，使用無菌去離子水，將初始大腸桿菌O157:H7菌液10倍系列稀釋至107CFU/mL。而后用移液管將1 mL大腸桿菌O157:H7菌液移至9 mL的營養(yǎng)肉湯中，以模擬食物基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)。將菌懸液置于LED光照系統(tǒng)下的無菌培養(yǎng)皿(D=60 mm)中。分別在12，25 ℃條件下，調(diào)節(jié)培養(yǎng)皿與LED光源間距分別為4.5，5.5，6.5 cm，采用LED藍(lán)光照射8 h，同時(shí)在沒有LED光照的情況下使用相同的裝置進(jìn)行對照試驗(yàn)，每間隔1 h取樣一次。參照Min-Jeong Kim等[18]的方法，按式(1)計(jì)算每個(gè)細(xì)菌受到的光照劑量。

E=Pt，

(1)

式中：

E——光照劑量，J/cm2；

P——輻照強(qiáng)度，mW/cm2；

t——光照時(shí)間，s。

1.2.4 檸檬酸對大腸桿菌O157:H7的抗菌試驗(yàn) 根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，本試驗(yàn)中擬定的檸檬酸質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg。制備檸檬酸溶液：分別取0.2，0.5，1.0 g檸檬酸，溶解于1 000 g去離子水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min；檸檬酸對大腸桿菌O157:H7生長影響試驗(yàn)：在超凈工作臺上，使用無菌去離子水，將初始大腸桿菌O157:H7菌液10倍系列稀釋至107CFU/mL，然后用移液管將1 mL大腸桿菌O157:H7菌液移至9 mL的營養(yǎng)肉湯中，再分別加入質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg的檸檬酸，空白對照組加入等量的無菌去離子水。試驗(yàn)懸菌液放置于無菌培養(yǎng)皿中，分別在溫度為12，25 ℃，且無光照條件下自然生長8 h，每間隔1 h取樣一次。

1.2.5 LED藍(lán)光與檸檬酸溶液的協(xié)同抗菌試驗(yàn) 在超凈工作臺上，使用無菌去離子水，將初始大腸桿菌O157:H7菌液10倍系列稀釋至107CFU/mL，然后用移液管將1 mL大腸桿菌O157:H7菌液移至9 mL的營養(yǎng)肉湯中，再分別加入質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg的檸檬酸，空白對照組加入等量的無菌去離子水。將試驗(yàn)菌懸液置于LED光照系統(tǒng)下的無菌培養(yǎng)皿中，固定培養(yǎng)皿與LED光源的間距為5.5 cm(輻照強(qiáng)度為85.8 mW/cm2)。分別在12，25 ℃的條件下光照8 h，每間隔1 h取樣一次。

1.2.6 菌落計(jì)數(shù)及抗菌效果的確定 在每個(gè)取樣間隔，用移液管取試驗(yàn)菌液和對照菌液100 μL，然后用無菌去離子水10倍系列稀釋所取樣品，最后取200 μL稀釋液于無菌培養(yǎng)皿中，倒入平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。在37 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h，然后進(jìn)行人工菌落計(jì)數(shù)?！翱咕Ч睘閷φ战M(CK)與試驗(yàn)組(CM)的試驗(yàn)結(jié)果差異。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 根據(jù)3次獨(dú)立試驗(yàn)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值。采用SAS 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差及顯著性分析。以試驗(yàn)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌落總數(shù)為縱坐標(biāo)，利用Origin 8.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LED輻照強(qiáng)度對大腸桿菌O157:H7抗菌效果的影響

細(xì)菌細(xì)胞中含有光敏物質(zhì)——卟啉，它們能夠吸收電磁光譜中特定波長的可見光。卟啉吸收光子后轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，在從激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛鶓B(tài)的過程中將能量釋放給不能吸收光子的氧化物，促使其發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧(ROS)。產(chǎn)生的活性氧包括超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基等，這些活性氧物質(zhì)通過細(xì)胞毒性方式與各種細(xì)胞成分如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等進(jìn)行反應(yīng)并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19]。LED光照破壞細(xì)胞的機(jī)理見圖2。

Bg. 基態(tài)卟啉 Be. 激發(fā)態(tài)卟啉 O. 氧化物 ROS. 活性氧圖2 細(xì)胞光敏化破壞的機(jī)理Figure 2 Mechanism of destructive action of photosensitization in the cell

由圖3可知，12 ℃時(shí)對照組中的大腸桿菌O157:H7數(shù)量變化并不明顯(P>0.05)。說明在12 ℃下，大腸桿菌O157:H7的細(xì)胞活性較低，生長速率緩慢。在使用3種不同輻照強(qiáng)度的LED藍(lán)光照射8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量均呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.05)。輻照強(qiáng)度為141.4 mW/cm2的光照抗菌效果最好，曲線下降趨勢最快(P<0.05)，在試驗(yàn)8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量相對于對照組減少了(2.60±0.19) lg CFU/mL。而在26.7，85.8 mW/cm2的輻照強(qiáng)度下光照8 h后大腸桿菌O157:H7 的數(shù)量相對于對照組僅減少了(1.17±0.13)，(1.87±0.08) lg CFU/mL。同時(shí)可觀察到，抗菌效果隨著輻照強(qiáng)度的增加而增強(qiáng)。

圖3 12 ℃下輻照強(qiáng)度對大腸桿菌O157:H7 抗菌效果的影響

Figure 3 Effects of irradiation intensity on antimicrobial activity ofEscherichiacoliO157: H7 at 12 ℃

由圖4可知，25 ℃時(shí)對照組中的大腸桿菌O157:H7數(shù)量呈不斷上升趨勢(P<0.05)，在8 h后增長至(8.16±0.16) lg CFU/mL。這表示在25 ℃下大腸桿菌O157:H7的細(xì)胞活性較強(qiáng)，生長速率較快。不難發(fā)現(xiàn)，在26.7 mW/cm2的輻照強(qiáng)度下光照8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量仍然呈現(xiàn)上升趨勢(P<0.05)，與對照組相比其數(shù)量減少了(1.11±0.10) lg CFU/mL，說明在該輻照強(qiáng)度下，LED光照僅表現(xiàn)為減緩其生長速率的作用。而使用輻照強(qiáng)度為141.4 mW/cm2LED藍(lán)光照射，其抑菌效果最好，在光照劑量達(dá)到4 072.3 J/cm2后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量相對于對照組減少了(2.82±0.10) lg CFU/mL。結(jié)合圖3和圖4可得出，無論溫度如何，LED輻照強(qiáng)度對于營養(yǎng)肉湯中的大腸桿菌O157:H7抗菌效果均有較大的影響。但在室溫下LED光照對大腸桿菌O157:H7細(xì)胞數(shù)量的控制不如低溫下的明顯，其原因可能是在低溫環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的酶活性降低，導(dǎo)致活性氧無法被及時(shí)清除。另一種可能的解釋是在低溫條件下，細(xì)胞的細(xì)胞膜流動(dòng)性減弱，從而抑制細(xì)胞的能量代謝，導(dǎo)致細(xì)胞對LED光照更加敏感[20]。

圖4 25 ℃下輻照強(qiáng)度對大腸桿菌O157:H7 抗菌效果的影響

Figure 4 Effects of irradiation intensity on antimicrobial activity ofEscherichiacoliO157: H7 at 25 ℃

2.2 檸檬酸質(zhì)量濃度對大腸桿菌O157:H7抗菌效果的影響

由圖5可知，對照組中大腸桿菌O157:H7的數(shù)量變化趨勢較平緩(P>0.05)，培養(yǎng)8 h后僅增加了(0.04±0.02) lg CFU/mL。在試驗(yàn)組中添加質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg 的檸檬酸培養(yǎng)8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量與對照組相比分別減少了(0.07±0.02)，(0.15±0.01)，(0.24±0.03) lg CFU/mL。結(jié)果表明，在低溫下，質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg 的檸檬酸對于大腸桿菌O157:H7的生長影響較小。

圖5 12 ℃下檸檬酸質(zhì)量濃度對大腸桿菌O157:H7 抗菌效果的影響

Figure 5 Effects of the mass concentration of citric acid on on antimicrobial activity ofEscherichiacoliO157: H7 at 12 ℃

由圖6可知，在室溫下對照組中大腸桿菌O157:H7的數(shù)量顯著增多(P<0.05)，試驗(yàn)8 h后迅速增長至(8.16±0.05) lg CFU/mL。同一時(shí)期在添加質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg 檸檬酸的試驗(yàn)組中，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量分別為(7.28±0.15)，(6.91±0.09)，(6.37±0.09) lg CFU/mL，說明在室溫下營養(yǎng)肉湯中的檸檬酸可延緩大腸桿菌O157:H7 的細(xì)胞生長速率。且隨著檸檬酸質(zhì)量濃度的提高，其對大腸桿菌O157:H7的生長抑制越明顯。結(jié)合圖5和圖6發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)中添加的3種質(zhì)量濃度的檸檬酸對于大腸桿菌O157:H7都有抑制作用，且在常溫下的抑制效果均優(yōu)于低溫環(huán)境的。檸檬酸的抑菌作用主要是其能夠穿過細(xì)菌的細(xì)胞膜，降低細(xì)胞內(nèi)pH，還能夠螯合金屬離子，并破壞細(xì)胞中蛋白質(zhì)以及細(xì)胞膜的合成系統(tǒng)。而在低溫環(huán)境下，細(xì)菌的細(xì)胞膜流動(dòng)性減弱，細(xì)胞代謝能量減緩，因此，與室溫下相比，在低溫條件下檸檬酸的抑菌效果較差。

圖6 25 ℃下檸檬酸質(zhì)量濃度對大腸桿菌O157:H7 抗菌效果的影響

Figure 6 Effects of the mass concentration of citric acid on on antimicrobial activity ofEscherichiacoliO157: H7 at 25 ℃

由圖7可知，12 ℃時(shí)對照組光照8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量減少至(4.18±0.04) lg CFU/mL。而添加質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg檸檬酸的試驗(yàn)組光照8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量均低于對照組(P<0.05)，相對于對照組其數(shù)量分別減少了(1.72±0.08)，(2.53±0.07)，(3.30±0.14) lg CFU/mL。

圖7 12 ℃下LED光照與檸檬酸對大腸桿菌O157:H7 的協(xié)同抗菌作用

Figure 7 Synergistic antimicrobial effects of LED and citric acid onEscherichiacoliO157: H7 at 12 ℃

由圖8可知，25 ℃時(shí)對照組光照8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量增加至(6.50±0.14) lg CFU/mL。而添加質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0 g/kg檸檬酸的試驗(yàn)組光照8 h后，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量明顯低于對照組(P<0.05)，其數(shù)量相對于對照組分別減少了(2.40±0.19)，(2.87±0.08)，(3.57±0.24) lg CFU/mL。結(jié)合圖7可知：無論溫度如何，檸檬酸均可增強(qiáng)LED藍(lán)光對于大腸桿菌O157:H7的抗菌效果，兩者具有協(xié)同抗菌作用。其原因是檸檬酸可與細(xì)菌細(xì)胞壁中的Ca2+和Mg2+相結(jié)合，導(dǎo)致磷脂和脂蛋白的釋放，使細(xì)胞壁的滲透性增加，進(jìn)一步惡化細(xì)胞的狀態(tài)。在LED光照期間，活性氧的主要目標(biāo)是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，而檸檬酸可能通過將這些化合物暴露于活性氧中來促進(jìn)LED光滅活[21]。

圖8 25 ℃下LED光照與檸檬酸對大腸桿菌O157:H7 的協(xié)同抗菌作用

Figure 8 Synergistic antimicrobial effects of LED and citric acid onEscherichiacoliO157: H7 at 25 ℃

3 結(jié)論

本研究表明，LED藍(lán)光可有效地滅活大腸桿菌O157:H7。同時(shí)食品中常用的檸檬酸，可顯著提高LED藍(lán)光對大腸桿菌O157:H7的抗菌效果。使用LED藍(lán)光照射大腸桿菌O157:H7，當(dāng)最大光照劑量為4 072.3 J/cm2時(shí)，大腸桿菌O157:H7數(shù)量能夠有效減少(2～4) lg CFU/mL。而添加檸檬酸后，當(dāng)最大光照劑量為2 471 J/cm2時(shí)，大腸桿菌O157:H7的數(shù)量能夠減少(3～6) lg CFU/mL。因此，本研究在食品保鮮領(lǐng)域開辟了新方法，對于天然酸性食品如水果、蔬菜、肉類等都具有適用性。由于該方法需要的光照時(shí)間較長，因而在食品加工階段的應(yīng)用可能受到一定限制，但它有可能被用作食品的保鮮與儲(chǔ)藏。后續(xù)研究將進(jìn)一步評估該方法對其他食源性病原體的抗菌效果以及對真實(shí)食物基質(zhì)的抗菌效果，因?yàn)榧?xì)菌病原體的行為可能因生存環(huán)境中化合物的類型和含量的差異而發(fā)生變化。

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