咸水灌溉棉田休耕期土壤胞外酶活性和微生物多樣性研究

梁悅萍，李科江，張俊鵬，王廣帥，高 陽，孫景生，段愛旺*

（1.中國農業科學院農田灌溉研究所／農業部作物需水與調控重點實驗室，河南 新鄉453002；2.河北省農林科學院旱作農業研究所，河北 衡水 053000；3.山東農業大學水利土木工程學院，山東 泰安 271000；4.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

土壤是陸地生態系統的核心[1]。微生物是土壤生物化學過程的重要參與者[2－3]，其通過降解土壤中動物殘體、植物凋落物以及自身呼吸作用，直接影響土壤關鍵化學元素循環。微生物群落多樣性是表征土壤質量變化的敏感指標，對土壤管理具有重要指示作用[4－5]。另外，由微生物、動植物活體分泌及由動植物殘體、遺骸分解釋放于土壤中的土壤胞外酶是一類具有催化能力的生物活性物質，其活性反映了土壤生物化學過程的方向與強度[6－8]。土壤胞外酶活性強弱直接影響土壤相關養分元素的可利用性，是土壤健康狀況的“指示器”[9]。農田是陸地生態系統的重要組成部分，全球耕地面積約占到陸地總面積的37.67%[10]。因此，研究農田土壤微生物群落多樣性以及土壤胞外酶活性對于評價農田土壤健康狀況、實現農田土壤科學管理至關重要。

灌溉是保障農田作物獲得高產、穩產的重要農業管理措施。我國75%以上的糧食產自于灌溉農田，可以說農田灌溉是滿足日益增長的人口口糧需求的基礎保障[11－12]。然而，我國也是一個淡水資源短缺的國家，淡水資源短缺已經對許多地區農業生產形成嚴重威脅。在淡水資源短缺不斷加劇的背景下，合理利用地下咸水資源進行灌溉已經成為農業生產中緩解淡水資源不足的較為經濟、有效的手段[13]。咸水灌溉一方面提供了作物生長所需要的水分，緩解旱情，適度維持大田作物產量；另一方面其也將多種鹽分帶入土壤，影響土壤滲透性[14]，造成土壤鹽漬化[15]，進而影響土壤的理化性質，造成土壤微生物活性發生改變[16－19]。例如：Wichern等[20]研究發現隨著土壤鹽分含量增加，土壤微生物活性指標值均下降；然而Wang等[21]卻發現鹽分處理能夠促進土壤微生物量的增加。雖然普遍認為鹽分脅迫是抑制微生物活性的主要非生物因素之一，但是部分耐受極端環境的微生物在鹽脅迫環境下反而被底物誘導，表現出較高活性[22]，從而使得不同鹽分濃度脅迫下土壤微生物群落多樣性以及活性表現出較高的不確定性。土壤胞外酶在關鍵化學元素循環轉化過程中扮演著不可替代的關鍵角色，多數研究認為其活性隨土壤鹽分含量升高而降低[23－25]，但王國棟等[26]卻發現堿性磷酸酶和多酚氧化酶活性隨土壤含鹽量的增加而升高。因此，不同種類土壤胞外酶對鹽分含量高低響應差異也很大。咸水灌溉引入農田土壤大量鹽分，然而不同礦化度灌溉水導致土壤鹽分含量各異，因此，開展不同礦化度灌溉水處理條件下土壤微生物群落多樣性和胞外酶活性的研究對于準確評價咸水灌溉生態安全性和土壤健康狀況顯得尤為必要。

河北低平原是我國淡水資源嚴重短缺的地區之一。棉花作為耐鹽抗旱能力較強的作物，在該區域種植面積非常大。翟紅梅[27]和馮棣等[23]分別對該區域咸水灌溉土壤微生物群落特征和胞外酶活性做了比較系統的研究，但是集中于作物生長季，缺乏關注休耕期狀況。休耕期土壤生物化學反應并未停止，為作物生長季儲備大量養分物質，對于農田地力恢復十分重要。因此，本研究通過測定不同礦化度咸水灌溉棉田休耕期土壤微生物群落狀況和胞外酶活性，分析鹽分濃度對土壤微生物群落特征和胞外酶活性的影響，為區域咸水灌溉安全性評價提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概括

試驗平臺位于河北省深州市的河北省農林科學院旱作節水農業試驗站（37°44′N，115°47′E）內，海拔21 m。該試驗站地處河北平原中部，屬暖溫帶大陸性季風氣候，多年平均氣溫12.8℃，無霜期188 d，日照時數2 509.4 h，多年平均蒸發量1 785.4 mm，降雨量500.3 mm且70%集中于夏季（6—8月）。試驗區土壤質地為壤土，地下水埋深大于5 m。土壤1 m土層平均田間持水率為28%，土壤容重為1.44 g·cm－3；土壤表層 0～20 cm 有機質含量為 11.5 g·kg－1，速效氮含量76 mg·kg－1，速效磷含量 15 mg·kg－1，速效鉀含量 112 mg·kg－1[28]。

1.2 試驗設計

試驗平臺灌溉方式為畦灌，依據灌溉水的礦化度設置了6個處理，每個處理3次重復，共18個小區，每個試驗小區面積37.62 m2（5.7 m×6.6 m），采用完全隨機區組設計。6個處理的灌溉水礦化度分別為淡水、2、4、6、8 g·L－1和 10 g·L－1，其中，淡水取自當地深層地下水，其他礦化度灌溉水由深層地下水摻兌海鹽配制而成。灌水下限均控制在田間持水率的65%。試驗采用棉花－休耕的種植模式，棉花栽培管理參見馮棣等[23]。用于培養與分析的土壤樣品采集于2015年11月9日，處于農田休耕期。按照“Z”字形用直徑2.5 cm土鉆取表層土（0～20 cm），共10個點，混勻后以四分法取樣。由于采樣時氣溫較低，故采集的土壤樣品在田間過2 mm網篩，手工去除可見的植物根系和有機質殘余，運送至實驗室，放置在4℃冰箱以備測定使用。

1.3 主要測定指標與方法

1.3.1 土壤微生物群落多樣性

采用含有31種碳源的Biolog ECO微平板分析微生物群落特征。首先，將待測土壤樣品在25℃培養箱培養活化1周；配制0.85%的氯化鈉溶液并在121℃高溫滅菌鍋中滅菌30 min；稱取1 g土壤樣品置于150 mL三角瓶中，加入99 mL 0.85%的氯化鈉溶液，將三角瓶以200 r·min－1的速度振蕩30 min。待前一過程制備的土壤溶液靜置20 min后，無菌條件下，吸取1 mL土壤懸濁液加入9 mL 0.85%的氯化鈉溶液，繼續吸取上述稀釋10倍的土壤懸濁液1 mL，加入9 mL 0.85%的氯化鈉溶液使土壤溶液稀釋100倍，測定其OD590值，在0.13±0.02范圍內（若大于0.13±0.02，則繼續稀釋10倍，使其稀釋倍數為1000倍）。最后，將稀釋土壤溶液搖勻，無菌條件下使用電動排槍吸取上清液150 μL加入Biolog ECO微平板，讀板。前3 d每隔12 h讀一次板，4 d后每隔24 h讀一次板。本試驗采用BIOLOG公司的EL808微孔板讀數儀在590 nm波長下對ECO板進行數據讀取，讀板時間分別為 12、24、36、48、72、96、120、144、168 h 和192 h。平均顏色變化率是反映土壤微生物代謝活性，即利用單一碳源能力的指標，相關計算公式參見鄒春嬌等[29]。

1.3.2 土壤胞外酶活性

稱取新鮮土壤樣品2.00 g，將土樣裝入120 mL振蕩瓶并加入100 mL Tris堿性緩沖溶液，以200 r·min－1的速度振蕩30 min，之后靜止30 min，用8通道排槍取100 μL土壤溶液加入96孔板，并加待測土壤胞外酶所對應的熒光標記底物100 μL，放入25℃培養箱黑暗培養3 h；將96孔板從培養箱取出，加50 μL的0.5 mol·L－1的NaOH溶液終止反應。利用酶標儀（帝肯，Infinite－200Pro，瑞士）在激發波長 365 nm 和發射波長450 nm下讀數，部分試驗步驟參見Jing等[30]。土壤胞外酶活性以nmol·g－1·h－1（DW）來表示，性質見表1。

表1 本試驗涉及土壤胞外酶性質Table 1 Fluorescent substrates of soil extracellular enzymes used in this experiment

1.4 數據處理

采用SPSS 22.0軟件進行方差分析（ANOVA）和多重比較（LSD），α=0.05；利用 Data Reduction工具對96 h的平均吸光度（AWCD）值進行主成分分析。采用SigmaPlot 12.5軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 咸水灌溉對土壤胞外酶活性的影響

由圖1 a可以看出，不同礦化度咸水灌溉對土壤α葡萄糖苷酶活性存在顯著影響。與淡水灌溉處理相比，高礦化度（6 g·L－1和 10 g·L－1）灌溉水處理能夠顯著降低α葡萄糖苷酶的活性，但低礦化度（2 g·L－1和4 g·L－1）和高礦化度（8 g·L－1）灌溉水處理僅有降低 α葡萄糖苷酶活性的趨勢，統計學上不顯著。不同礦化度咸水灌溉處理之間也存在顯著差異，其中在2、4 g·L－1和 8 g·L－1處理下，土壤 α 葡萄糖苷酶活性顯著高于 10 g·L－1處理，同時，4 g·L－1處理也顯著高于 6 g·L－1處理。通過圖1b、圖1c可以發現不同礦化度灌溉水處理并沒有對土壤β葡萄糖苷酶活性和乙酰氨基葡萄糖苷酶活性產生顯著影響（P＞0.05）。通過圖1d可以看出，纖維素二糖酶對咸水灌溉響應強烈，且纖維素二糖酶活性隨著灌溉水礦化度升高而顯著降低。與淡水灌溉處理相比，高礦化度（6、8 g·L－1和 10 g·L－1）灌溉水處理顯著降低了土壤纖維素二糖酶活性，降幅分別達到了53.25%、56.50%和81.03%；而低礦化度（2 g·L－1和 4 g·L－1）灌溉水處理條件下僅有降低的趨勢，統計學上不顯著；對不同礦化度咸水灌溉處理之間比較后發現，土壤纖維素二糖酶活性在2 g·L－1處理下顯著高于高礦化度（6、8 g·L－1和 10 g·L－1）灌溉水處理，而4 g·L－1灌溉水處理則顯著高于高礦化度（8 g·L－1和 10 g·L－1）灌溉水處理。由圖 1e 可以看出，隨著灌溉水礦化度的升高，土壤磷酸酶的活性逐步減弱。與淡水灌溉處理相比，灌溉水礦化度增加均能顯著降低土壤磷酸酶的活性；并且不同礦化度灌溉水處理之間同樣存在顯著性差異，其中2 g·L－1灌溉水處理顯著高于高礦化度（6、8 g·L－1和 10 g·L－1）灌溉水處理，4 g·L－1灌溉水處理則顯著高于高礦化度（8 g·L－1和 10 g·L－1）灌溉水處理，而 6 g·L－1灌溉水處理僅高于 10 g·L－1灌溉水處理下的土壤磷酸酶活性，8 g·L－1處理和10 g·L－1處理之間無顯著差異。由圖1f可以看出，β木糖苷酶活性顯著受到灌溉水礦化度的影響。與淡水灌溉處理相比，雖然灌溉水礦化度增加能夠降低土壤β木糖苷酶活性，但僅有高礦化度（8 g·L－1和10 g·L－1）灌溉水處理達到了顯著水平，隨著灌溉水礦化度增加，咸水灌溉處理之間土壤β木糖苷酶活性差異逐漸顯著。

圖1 不同礦化度灌溉水處理對土壤胞外酶活性的影響Figure 1 Effects of saline water irrigation on soil enzyme activity

2.2 咸水灌溉對土壤微生物群落的影響

2.2.1 平均顏色變化率

平均吸光度（AWCD）隨時間的變化可以用來表征土壤微生物對碳源利用水平的高低，能夠直觀地體現土壤微生物群落對不同碳源的響應速度和最終達到的程度。不同礦化度咸水灌溉處理下AWCD隨培養時間的動態變化曲線如圖2所示。可以看出AWCD在培養初期（12 h）均較低，但隨著時間的推移，低礦化度（淡水、2 g·L－1和 4 g·L－1）灌溉水處理 AWCD 隨著時間的推移逐步增大，到136 h后微生物活性趨于平穩；但是高礦化度（6、8 g·L－1和 10 g·L－1）灌溉水處理下，AWCD隨著時間的推移無明顯變化趨勢。與淡水灌溉處理相比，2 g·L－1處理顯著增加了AWCD值，增幅近80%。而其他礦化度灌溉水處理均顯著降低土壤微生物AWCD值，并且減弱作用隨灌溉水礦化度的增加而加強。

圖2 不同咸水灌溉處理下土壤微生物平均吸光度（AWCD）變化特征Figure 2 Average well color development（AWCD）of Biolog ECO plates under different saline water irrigation treatments

2.2.2 群落多樣性分析

根據Biolog ECO培養板所有微孔光密度數據，參考相關計算公式對不同礦化度咸水灌溉條件下的土壤微生物多樣性進行計算，結果見表2。從表2可以看出，在不同咸水灌溉處理下，4種土壤微生物多樣性指數均存在顯著差異。在8 g·L－1處理下Shannon－wiener指數（H′）值顯著高于低礦化度咸水灌溉（2 g·L－1和 4 g·L－1）處理和淡水灌溉處理；其總體上呈現從淡水處理到咸水灌溉處理先降低再增高而后又降低的趨勢。2 g·L－1處理的 Mcintosh指數（U）值顯著高于其他處理，其次是淡水處理高于高礦化度（6、8 g·L－1和 10 g·L－1）處理，總體上呈現從淡水處理到咸水灌溉處理先增高后下降的趨勢。對于Simpson指數（D），最大值出現在 8 g·L－1處理，其次是 10 g·L－1處理，淡水灌溉與各個咸水灌溉處理均無顯著性差異，但是咸水灌溉處理之間的D值存在顯著差異。從淡水到咸水灌溉處理來看，總體呈現先下降后增高而后又下降的趨勢。2 g·L－1處理下豐富度指數最高，其次是淡水灌溉處理，隨著灌溉水的礦化度增加豐富度指數急劇下降。

2.2.3 碳源利用性特點分析

為研究不同礦化度咸水灌溉對土壤微生物群落碳源利用影響的特點，選擇96 h作為取樣分析點進行主成分分析。分別提取兩個主成分，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）。樣方間距離的長短表征處理之間的相似程度，距離越接近表示相似度越高。圖3是不同礦化度咸水灌溉處理條件下土壤微生物群落多樣性主成分分析結果。可以看出，2 g·L－1處理分布在第一象限，與其他咸水灌溉（4、6、8 g·L－1和 10 g·L－1）處理分布在第四象限的土壤微生物群落多樣性存在顯著區別；淡水處理分布在第三象限，也和2 g·L－1處理之間存在明顯差異。相比淡灌溉處理，咸水灌溉對土壤微生物群落產生的影響存在差異，并且不同礦化度處理之間也存在顯著差異。

表2 不同礦化度咸水灌溉模式下微生物群落多樣性指數Table 2 Microorganism diversity under different saline water irrigation treatments

圖3 不同鹽分梯度咸水灌溉下土壤微生物群落多樣性主成分分析Figure 3 Principal analysis of the function diversity of saline－irrigated soil

按照底物碳源化學基團的性質，Biolog Eco板上的31種碳源劃分為6大類：糖類、氨基酸類、胺類、羧酸類、酯類以及醇類。將不同礦化度咸水灌溉處理下的6種碳源分別計算AWCD值見圖4。就醇類來講，低礦化度咸水灌溉（2 g·L－1和 4 g·L－1）能夠顯著促進微生物對醇類的利用，并且利用率隨時間的推移而增大，到120 h時處于穩定狀態，其中2 g·L－1處理下的AWCD值也顯著高于4 g·L－1處理。淡水處理的醇類底物利用能力顯著低于低礦化度咸水灌溉（2 g·L－1和4 g·L－1）處理，但卻顯著高于高礦化度咸水灌溉（6、8 g·L－1和 10 g·L－1）處理，6 g·L－1處理下的 AWCD 值高于 10 g·L－1處理（圖 4a）。就酯類來講，2 g·L－1處理下AWCD值最高，并且也具有隨時間延續而增大的趨勢，到144 h后趨于穩定，其次是淡水下的AWCD值，該值顯著低于2 g·L－1處理，但顯著高于其他礦化度處理（4、6、8 g·L－1和 10 g·L－1）。對于糖類來講，咸水灌溉隨著礦化度的增加，有先促進后減弱微生物對糖類碳源利用的趨勢。其中，相對于淡水處理，2 g·L－1處理能夠顯著促進土壤微生物對糖類碳源的利用（圖4c），而其余礦化度咸水灌溉均顯著減弱了土壤微生物對糖類碳源的利用。對于羧酸類來講，2 g·L－1處理下的微生物AWCD依然最高，且隨時間的推移而增大，到達72 h時保持穩定。通過統計發現，除2 g·L－1的微生物AWCD最高外，淡水處理下土壤微生物AWCD依然高于4 g·L－1處理和高礦化度咸水灌溉處理（6、8 g·L－1和 10 g·L－1），并且 4 g·L－1處理下的AWCD也高于高礦化度咸水灌溉處理。對于氨基酸類來講，淡水灌溉和2 g·L－1咸水灌溉處理下土壤微生物AWCD值最高且之間無差異，其余咸水灌溉處理顯著低于兩者，但是6 g·L－1處理下土壤微生物AWCD最低。對于胺類來講，2 g·L－1和 6 g·L－1處理下土壤微生物AWCD值明顯高于其他處理，并且2 g·L－1處理顯著高于6 g·L－1處理下的土壤微生物AWCD值，其余處理AWCD值均較小，僅有淡水處理下的AWCD超過了0.05。不同鹽分梯度咸水灌溉條件下，土壤微生物對6種碳源的利用由強到弱依次為醇類＞氨基酸類＞羧酸類＞糖類＞胺類＞酯類。

3 討論

3.1 咸水灌溉對土壤胞外酶活性的影響

土壤鹽漬化是影響土壤胞外酶活性的主要因素之一。本研究結果表明多種土壤胞外酶活性隨著咸水灌溉礦化度的增加而減弱，這可能是由于咸水灌溉將大量鹽分引入土壤，抑制了土壤微生物活性，減少了微生物數量，從而致使活體微生物分泌酶的數量減少。長期咸水灌溉對土壤微環境產生的負面影響不容忽視，應是將來水資源短缺加劇狀況下咸水資源開發利用環境評價的重要內容。雖然咸水灌溉對多種土壤胞外酶都有抑制作用，但是抑制程度隨胞外酶種類的變化有很大差異。咸水灌溉礦化度對土壤纖維素二糖酶活性、磷酸酶活性以及β木糖苷酶活性的抑制作用較強，而對α葡萄糖苷酶活性和β葡萄糖苷酶活性的抑制作用相對較弱。另外，本研究還發現咸水灌溉對乙酰氨基葡萄糖苷酶活性有促進作用。這可能是由于產生不同胞外酶所對應的微生物種類不同，而這些微生物對土壤鹽分的耐受性也不同。土壤理化性質是土壤微生物活性的直接影響因素，咸水灌溉也可通過改變土壤理化性質而間接地影響微生物活性，乃至胞外酶活性。例如：Min等[33]發現微咸水和咸水灌溉處理下土壤脲酶活性顯著高于淡水處理，就是因為微咸水和咸水灌溉顯著改變了土壤理化性質，從而導致脲酶活性增加。Zahran[34]指出耐鹽型細菌所產生的土壤酶活性高于不耐鹽型細菌所產生的相應土壤酶的活性，這表明胞外酶活性強弱和相應微生物的耐鹽性有關。休耕期土壤胞外酶活性與生長季測定數據（未列出）相比，沒有顯著性差異。馮棣等[23]在該區域相關研究也發現了類似的結果。這說明休耕期土壤胞外酶仍然處于高度活化狀態，對土壤關鍵養分元素的周轉并沒有停止，休耕期對農田土壤儲能、休養生息非常關鍵。咸水灌溉引入土壤大量鹽分離子，對土壤微生物細胞生理和代謝過程產生脅迫[19]，影響了微生物活性[35]和微生物數量[36]，也可能改變土壤理化性質[37]，從而直接或間接地改變土壤胞外酶活性，其中有些酶對土壤鹽分含量不敏感，但是土壤α葡萄糖苷酶、纖維素二糖酶、磷酸酶和β木糖苷酶對灌溉水礦化度反應相對敏感，亦可作為咸水灌溉棉田土壤質量評價的靈敏指標。

圖4 咸水灌溉土壤對不同碳源的利用Figure 4 Utilization of carbon sources by soil microorganisms under different saline water irrigation treatments

3.2 咸水灌溉對土壤微生物群落的影響

較低水平鹽分咸水灌溉對微生物活性有促進作用，而較高水平的鹽分則顯著抑制土壤微生物的活性[38]。本研究發現土壤微生物代謝水平（AWCD值）在礦化度較低的灌溉處理下較高，而隨著灌溉水礦化度的增加而下降。與本研究同一站點的研究也發現相似結果，相比對照處理，2.5 dS·m-1礦化度灌溉水處理并沒有降低土壤細菌豐度，而隨著灌溉水礦化度升高，土壤細菌數量顯著降低，10 dS·m-1礦化度灌溉水處理相比對照下降高達50.2%[27]。這主要是因為較低礦化度咸水灌溉能夠促進土壤微生物產生應激反應，刺激微生物數量的增加和活性的加強。另外，有關咸水灌溉棉田土壤微生物群落特征的研究卻發現，土壤微生物群落AWCD值、土壤微生物群落多樣性Shannon指數和豐富度指數均隨鹽濃度的升高而逐漸降低[39]，而本研究結果卻發現棉田土壤微生物群落多樣性Shannon指數和豐富度指數隨鹽濃度的升高有先增高后降低的趨勢，可能是由兩個實驗土壤性質差別較大所致。這也說明低礦化度咸水灌溉或微咸水灌溉對土壤微生物群落多樣性影響存在較大不確定性。今后，應該加強微咸水灌溉對土壤理化性質以及微生物環境的影響方面的研究。翟紅梅[27]在與本研究同一站點開展的冬小麥咸水灌溉試驗發現，長期咸水灌溉對土壤細菌多樣性影響結果與本研究結果類似，這可能是由于小尺度環境下土壤微生物群落組成較為相近。本研究發現較高礦化度咸水灌溉顯著降低了土壤微生物群落組成，但低礦化度咸水灌溉對土壤微生物群落組成的影響隨地域等因素變化而不同。

4 結論

（1）不同礦化度咸水灌溉顯著改變了土壤胞外酶活性。土壤鹽分含量狀況對土壤胞外酶活性有促進或抑制作用，說明咸水灌溉對土壤健康狀況的影響較為復雜。休耕期土壤胞外酶活性仍然保持較高水平，農田實行冬季休耕，仍能保持較高的養分元素轉化效率，促進土壤養分元素積累，對于提升土壤質量十分有利。

（2）不同礦化度咸水灌溉對土壤微生物群落多樣性影響不同。低礦化度灌溉水可以促進土壤微生物產生應激效應，促使微生物快速生長并加快土壤營養元素轉化速率；而高礦化度灌溉水則會抑制土壤微生物生長和養分元素轉化。水分短缺背景下，適當實施微咸水灌溉可能會提高棉田土壤微生物活性和養分元素轉化速率。

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