Claudin-1在前列腺癌中的表達及與臨床病理相關性

張春霆，周國宏，盧 蓉，孔 麗

（1浙江大學金華醫院，金華市中心醫院泌尿外科，浙江 金華321000；2山西省眼科醫院，山西 太原 030002；3浙江省金華市人民醫院婦產科，浙江 金華321000；4山西醫科大學解剖學教研室，山西太原030001）

0 引言

腫瘤發生發展有多種途徑，例如干細胞演化、自噬消失、信號通路異常、DNA損傷修復異常［1-4］，多個基因突變及異常表達可能參與了腫瘤的發生與進展，前列腺癌與其他腫瘤一樣，也可能有多種因素參與，研究［5-8］顯示Claudins可能參與多種腫瘤的發生，也有報道［9-10］其家族成員與前列腺癌的關系。本研究利用SP法對Claudin-1在前列腺癌中的表達進行檢測，探討其與前列腺癌的臨床特征及病理之間的關系。

1 材料與方法

1．1 一般資料 取浙江大學金華醫院和山西醫科大學2010～2015年病理組織庫前列腺癌組織標本72 例，年齡 51～79 歲，中位年齡（68．5±5．5）歲。 前列腺癌分為Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期33例。Gleason評分＜7分的38例，Gleason評分≥7分的34例。前列腺增生組織42例，年齡52～82歲，中位年齡（69．5±6．5）歲。兩組一般狀況比較，差異無統計學意義。所有患者術前均未接受放化療和內分泌治療，所有標本10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后3 μm連續切片。

1．2 實驗方法 構建8×8點陣的組織芯片2個，一個免疫組化染色，一個陰性對照。對標記的組織利用點陣儀打點取樣在多聚賴氨酸載玻片上。每例前列腺癌標本和前列腺增生標本均取1個點，6 h烤片，芯片制作完成。應用SP法進行兔抗人Claudin-1蛋白單克隆抗體免疫組化染色。各步驟間均以0．1%PBS洗5 min×3次，后DAB顯色（SP試劑盒和 DAB顯色劑均為北京中杉生物技術公司產品），脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1．3 結果判定 Claudin-1染色主要是細胞膜出現棕紅色顆粒為陽性染色，根據陽性表達細胞數決定表達陽性。陽性表達細胞數＜10%為（-），陽性表達細胞數 10%～25%為（+），陽性表達細胞數＞50%為（++），陽性表達細胞數＞75%為（+++）。陽性表達細胞數（++）以上為陽性。

1．4 統計學處理 前列腺癌染色結果數據采用SPSS20．0統計學分析，對兩樣本陽性率比較進行χ2檢驗或Fisher概率法，p＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 Claudin-1在前列腺癌中的表達位置 免疫組化染色結果Claudin-1主要表達于細胞膜上。Claudin-1在前列腺癌中表達明顯高于前列腺增生；前列腺增生陽性表達率33．33%（14／42），前列腺癌 Claudin-1 陽性表達率為 63．89%（46／72）（p＜0．05，表 1）。

A：Claudin-1在前列腺增生中的表達（×400）；B：Claudin-1在前列腺癌中的表達（×400）

表1 Claudin-1在前列腺癌和前列腺增生中的表達

2．2 Claudin-1與前列腺癌Gleason評分和臨床分期之間的關系 Claudin-1在34例前列腺癌≥7分的陽性表達率為 76．47%（26／34），38 例前列腺癌＜7 分的陽性表達率為 52．63%（20／38），兩者之間比較差異有統計學意義（p＜0．05）。 Claudin-1在前列腺癌Ⅰ～Ⅱ期陽性表達率為52．63%（20／38），Ⅲ～Ⅳ期陽性表達率為 76．47%（26／34），差異有統計學意義（p＜0．05，表 1）。

3 討論

前列腺癌發病率在我國呈現上升趨勢［11］。一段時間內，由于我國對前列腺癌篩查率低，部分患者發現時已是晚期。前列腺癌與多種基因相關。我們前期發現緊密連接蛋白參與了多種腫瘤的發生發展，它的異常導致上皮屏障遭到破壞，細胞間粘附力下降［12-13］。Claudin-1基因是其家族成員之一，其翻譯的蛋白是構成緊密連接的必需成分，參與維持細胞的極性和細胞間屏障功能，并且在細胞間的傳輸轉運及信號傳導中起重要作用［14-15］。

Claudins蛋白表達有組織相關性，不同組織中Claudins蛋白表達不同，即使是同一組織表達的Claudins蛋白也有較大區別，目前認為Claudins蛋白表達異常與細胞間粘附性丟失的機制及腫瘤轉移有關。然而，在一些腫瘤組織中，Claudin-1表達較正常組織下降，這也意味著Claudin-1表達下降可能也在腫瘤的發生中起參與作用。本研究采用組織芯片及免疫組化技術對前列腺癌和前列腺增生中Claudin-1表達狀況進行了分析，檢測結果顯示，Claudin-1主要表達在細胞膜上，在胞質及胞核中表達不明顯。Claudin-1在前列腺癌中呈高表達；前列腺癌和前列腺增生中 Claudin-1陽性表達率分別為63．89%（46／72）和 33．33%（14／42）。 Claudin-1 表達在 Gleason評分＜7 分的陽性表達率為 52．63%（20／38），在Gleason評分≥7 分的表達率為 76．47%（26／34），差異有統計學意義（p＜0．05）。在前列腺癌臨床Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期陽性表達率分別為52．63%（20／38）和79．41%（26／34），差異有統計學意義（p＜0．05）。 說明其表達與前列腺癌的臨床分期及Gleason評分有關，可能參與前列腺癌進展，至于它在前列腺癌進展中如何作用有待進一步研究。雖然本研究也發現Claudin-1與前列腺癌臨床病理和臨床分期相關，但是確切的發病機制并沒有明確。

國內有利用組織芯片技術及免疫組化方法檢測Claudin-1和Claudin-3蛋白在食管癌組織和癌旁黏膜中的表達，探討Claudin-1和Claudin-3蛋白在食管癌發生發展中的作用。結果發現Claudin-1和Claudin-3蛋白陽性表達主要見于食管癌細胞膜，其次表達在細胞質中，在食管鱗癌組織和癌旁組織中Claudin-1及Claudin-3的表達率分別為 76．4%和 38．3%與24．6%和79．2%，食管鱗癌的發生可能與Claudin-1的表達上調及Claudin-3的表達下調有關［16］。也有對結腸癌中Claudin-1表達狀況進行了研究，結果表明，隨著腫瘤的病理進展，Claudin-1表達增高，推測其作用機制是通過增高表達的使E-鈣黏蛋白表達減少，引起β-catenin在細胞內聚集，致使 β-catenin／Tef信號通路上調，促進Claudin-1高表達，還可導致金屬基質蛋白酶-2活性增強，促進Claudin-4高表達。兩者共同作用引起緊密連接蛋白結構和功能破壞，導致組織黏附力下降或黏附分子破壞。腫瘤細胞易脫離原發灶，黏附于周圍間質或正常細胞基膜、血管、淋巴管。腫瘤細胞遷涉力、侵襲力增加促進腫瘤浸潤，最終導致淋巴結轉移［17］。本研究不僅對Claudin-1在前列腺癌中定位進行了觀察，并對Claudin-1在前列腺癌臨床分期及分級特征進行了實驗研究，結果顯示Claudin-1異常表達可能參與了前列腺癌的發生進展。雖然實驗中Claudin-1在前列腺癌中表達不具有特異性，例如在乳腺癌中，Claudin-1卻是丟失的，這種情況被認為細胞的極性丟失和細胞間生長因子失衡會以自分泌或旁分泌形式刺激上皮細胞發生乳腺腫瘤［18］。在宮頸癌中，Claudin-1表達是上升的，可能由于宮頸癌與HPV直接相關，HPV刺激Claudin-1改變有關。本研究對Claudin-1在前列腺癌中的作用機制雖未闡明，但早期聯合檢測也可能對前列腺癌的早期診斷有參考價值，并對預后評估有重要意義。

本研究將免疫組化和組織芯片技術相結合，對前列腺癌中Claudin-1蛋白進行了實驗研究。研究結果證實Claudin-1與前列腺癌的發生發展有關，但因為Claudin-1功能復雜多樣，其在前列腺癌中的作用尚需更進一步研究證實。

【參考文獻】

［1］涂艷陽，楊宏偉，徐小珊．NF-κB信號通路在膠質瘤細胞凋亡中作用機制的研究進展［J］．轉化醫學電子雜志，2016，3（8）：1-3．

［2］鄧展濤，金潔雯，趙建寧，等．自噬在腫瘤治療中的臨床轉化［J］．轉化醫學電子雜志，2017，4（3）：12-16．

［3］涂艷陽，王 震，張永生，等．腫瘤干細胞的分子機制和調控通路［J］．轉化醫學電子雜志，2016，3（11）：1-7．

［4］劉 力．癌基因誘發的DNA損傷反應與腫瘤生成［J］．轉化醫學電子雜志，2017，4（5）：1-3．

［5］ Dubé E， Dufresne J， Chan PT， et al．Assessing the role of claudins in maintaining the integrity of epididymal tight junctions using novel human epididymal cell lines［J］．Biol Reprod，2010，82（6）：1119-1128．

［6］ Suh Y，Yoon CH，Kim RK et al．Claudin-1 induces epithelial-mesenchymal transition through activation of the c-Abl-ERK signaling pathway in human liver cells［J］ ．Oncogene，2017，36（8）：1167-1168．

［7］ Choi Y， Abdelmegeed MA， Song BJ．Preventive effects of indole-3-carbinol against alcohol-induced liver injury in mice via antioxidant，anti-inflammatory，and anti-apoptotic mechanisms： Role of gut-liveradipose tissue axis［J］ ．J Nutr Biochem，2017，55：12-25．

［8］ Aslam M， Ahmad N， Srivastava R， et al．TNF-alpha induced NFκB signaling and p65（RelA） overexpression repress Cldn5 promoter in mouse brain endothelial cells［J］．Cytokine，2012，57（2）：269-275．

［9］ Ashikari D， Takayama KI， Obinata D， et al．CLDN8， an androgenregulated gene，promotes prostate cancer cell proliferation and migration［J］ ．Cancer Sci，2017，108（7）：1386-1393．

［10］ Worst TS， Von Hardenberg J， Gross JC， et al．Database-augmented mass spectrometry analysis of exosomes identifies claudin 3 as a putative prostate cancer biomarker［J］．Mol Cell Proteomics，2017，16（6）：998-1008．

［11］葉定偉．前列腺癌的流行病學和中國的發病趨勢［J］．中華外科雜志，2006，44（6）：362-364．

［12］ Kim SS， Kim CH， Kim JW， et al．Airborne particulate matter increases MUC5AC expression by downregulating Claudin-1 expression in human airway cells［J］．BMB Rep，2017，50（10）：516-521．［13］ Chen WY，Wang M， Zhang JW，et al．Acrolein disrupts tight junction proteins and causes endoplasmic reticulum stress-mediated epithelial cell death leading to intestinal barrier dysfunction and permeability［J］ ．Am J Pathol，2017，187（12）：2686-2697．

［14］ Zihni C， Mills C， Matter K， et al．Tight junctions：from simple barriers to multifunctional molecular gates．［J］ ．Nat Rev Mol Cell Biol，2016，17（9）：564-580．

［15］ Tran KA， Zhang XM， Predescu D， et al．Endothelial β-catenin signaling is required for maintaining adult blood-brain barrier integrity and central nervous system homeostasis［J］．Circulation，2016，133（2）：177-186．

［16］郭 琦，唐芙愛，李 印，等．Claudin-1和Claudin-3在食管鱗癌中的表達［J］．中國腫瘤臨床，2009，36（6）：340-344．

［17］田笑笑，杜 浩，鄭玉峰，等．重建Smad4基因對結腸癌細胞中Claudin-1、MMP-7 mRNA 表達的影響［J］．實用醫學雜志，2013，29（17）：2787-2789．

［18］ Swisshelm K，Macek R，Kubbies M．Role of claudins in tumorigenesis［J］．Adv Drug Deliv Rev，2005，57（6）：919-928．