低分子量膠原蛋白肽交叉苦瓜素輔助降低糖尿病小鼠血糖作用特性

歐愛寧,段 東,王 婷,張靜怡,郭銳華,吳文惠,2,包 斌,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306)

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是繼心腦血管疾病和癌癥之后危害人類健康的第三大疾病,被世界衛生組織稱之為“21 世紀的災難”。我國已有近5億人口患有前驅糖尿病[1],其中Ⅱ型糖尿病占臨床病例的90%以上。胰島B細胞缺陷導致胰島素分泌不足引起高血糖是形成糖尿病的原因之一[2]。目前,用于糖尿病臨床治療的降血糖化學藥物主要有二甲雙胍JP2、格列本脲、瑞格列奈、阿卡波糖、羅格列酮等,長期服用,會導致患者身體產生耐藥性,甚至引起低血糖等多種毒副作用[3-4]。因此,開發新型、高效低毒促進胰島素分泌的藥物成為生物醫藥領域關注的熱點。

研究發現,膠原蛋白Ⅰ型和Ⅲ型在中期和晚期糖尿病大鼠的大血管中顯著增加,中藥組方加味桃核承氣湯被證實能有效降低致纖維化因子膠原蛋白在糖尿病大鼠大血管病變中的表達,從而起到改善糖尿病大血管彈性的作用,這表明糖尿病大血管病變可能與膠原蛋白有關[5]。膠原蛋白多肽-鉻(Ⅲ)螯合物經口投與小鼠,其IgG抗體增加、細胞因子IL-2和TNF-α分泌增強、IL-6的分泌降低,膠原蛋白多肽-鉻(Ⅲ)螯合物被證明具有活化免疫細胞、恢復和改善小鼠機體的免疫功能的作用,促進肝糖原的合成和糖尿病小鼠體內的葡萄糖磷酸化[6-7]。膠原蛋白多肽-鉻(Ⅲ)螯合物可降低糖尿病小鼠血糖,目前國內外關于膠原蛋白肽與糖尿病降血糖關系的研究只局限于全分子量的膠原蛋白肽,而對于低分量的膠原蛋白肽交叉苦瓜素輔助降血糖方面的研究還是一片空白。

本研究首次采用海洋生物低分子量膠原蛋白肽交叉植物提取物苦瓜素灌胃糖尿病小鼠,通過形態學觀察以及對血糖、臟器指數、葡萄糖耐受量和肝臟組織抗氧化能力的測定,研究低分子量膠原蛋白肽交叉苦瓜素對四氧嘧啶誘導的實驗性糖尿病小鼠的降血糖作用,并探討其可能的降血糖途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石斑魚骨膠原蛋白肽(Collagenpeptide of Epinephelussp,GBB-10SP)(相對分子質量為800～1000 Da占90%以上)、羅非魚皮膠原蛋白肽(Collagenpeptide of Oreochromis mossambicus,TYPE-S)(相對分子質量為800～1000 Da占90%) 實驗室自制;苦瓜素(Momordicacharantiaextracts,MCE) 含量10%,西安天寶生物科技有限公司;四氧嘧啶 東京化成工業株式會社;丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒 南京建成生物工程研究所;ICR雌性小鼠 72只,清潔級,四周齡,許可證號SCXK(滬)2013～0006,14～16 g,自然晝夜,自由進水,分籠飼養,上海杰思捷實驗動物有限公司。

-80 ℃超低溫冷凍冰箱 海爾股份有限公司;Mcroplate Reader SH-1000酶標儀 Corona Electric Co.,Ltd;三諾血糖試紙 三諾生物傳感器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GBB-10SP及TYPE-S的制備 參照文獻[8-9]的方法進行制備。原料用磷酸氫二鈉(10 mmol/L pH7.4～7.6)緩沖液浸泡沖洗,切成小塊,再用水沖洗。清洗干凈的原料進行組織溶脹和脫脂,用0.1 mol/L NaOH在室溫下浸泡3 d,用水充分清洗堿處理后的原料,至pH6.5～7.5。用胃蛋白酶醋酸緩沖液在4 ℃進行限制性酶解24 h,3000 r/min 離心收集上清,沉淀在上述的條件再次酶解。合并兩次酶解液,10000 r/min離心30 min,取上清,于去離子水中透析,3 h更換一次透析水,直至透析水pH為中性。經透析的膠原蛋白液減壓濃縮之后,得到膠原蛋白濃縮液。再通過胰蛋白酶酶解,pH維持在8左右,水解溫度為47 ℃,酶解60 min,分離純化后,得到相對分子量800～1000 Da的膠原蛋白肽。

1.2.2 小鼠糖尿病模型的建立 健康雌性ICR小鼠72只,適應性喂養1周,隨機取8只作空白對照組,其余64只腹腔注射四氧嘧啶180 mg/(kg·bw)(四氧嘧啶臨用前用生理鹽水配制),空白對照組小鼠注射等量的生理鹽水,3 d后斷尾取血,血糖儀測定空腹血糖,血糖≥11.1 mmol/L[10-11]的動物用于實驗。

1.2.3 小鼠的降血糖實驗 依據體重與血糖均衡原則隨機分為8組,每組8只,分為模型組(0.86%生理鹽水)、陽性對照組(二甲雙胍,1 mg/kg·bw/d)、低劑量GBB-10SP交叉苦瓜素處理組(LGinterMCE,3.6 g/kg·bw/d)、中劑量GBB-10SP交叉苦瓜素處理組(MGinterMCE,10.8 g/kg·bw·d)、高劑量GBB-10SP交叉苦瓜素處理組(HGinterMCE,18 g/kg·bw/d)、低劑量TYE-S交叉苦瓜素處理組(LTinterMCE,3.6 g/kg·bw/d)、中劑量TYPE-S 交叉苦瓜素處理組(MTinterMCE,10.8 g/kg·bw·d)、高劑量TYPE-S 交叉苦瓜素處理組(HTinterMCE,18 g/kg·bw/d)。

對DM小鼠前15 d分別灌胃GBB-10SP和TYPE-S,第16 d開始灌胃苦瓜素,其中模型組B及對照組A給予等體積的生理鹽水灌胃,各組連續給藥28 d。

1.2.4 形態學觀察指標 實驗期間每天觀察記錄小鼠的進食狀況、皮毛、精神狀況、排尿量及其體重變化。

1.2.5 血糖檢測方法 各組小鼠連續喂養28 d,將9組小鼠只禁食不禁水過夜,于次日早上8:00 尾靜脈取血用快速血糖儀測定小鼠空腹血糖值,每隔4 d檢測一次,計算血糖下降百分率。

血糖下降百分率(%)=(實驗前血糖值-實驗后血糖值)/實驗前血糖值×100

1.2.6 臟器指數檢測方法 實驗第28 d,麻醉處死小鼠,解剖,取小鼠脾臟、肝臟、腎臟稱濕重,其肝臟、腎臟和脾臟,肉眼觀察有無病變,用冷生理鹽水沖洗,濾紙吸干殘留水分,稱重,計算肝臟指數、腎臟指數、脾臟指數。計算公式為:

1.2.7 葡萄糖耐量檢測方法 DM小鼠給藥21 d 后,禁食過夜,于次日早上8:00給藥,60 min后再灌胃給予50 mmol/kg 葡萄糖,用快速血糖測定儀測定小鼠灌胃前(0 min)、灌胃后30、120 min的血糖值,并計算葡萄糖耐量曲線下面積(Area Under Curve,AUC)。

AUC=(X0+4×X30+3×X120)/4

注：X0表示灌胃前(0 min)血糖值；X30表示灌胃后30 min血糖值；X120表示灌胃后120 min血糖值。

1.2.8 肝組織抗氧能力檢測方法 實驗第28 d,麻醉處死小鼠,解剖取小鼠肝臟,用10%的生理鹽水清洗去血漬和剪除其他結締組織,稱重,剪碎加入9倍體積0.86%生理鹽水,勻漿,離心(2500 r/min,10 min)后取上清液,用丙二醛試劑盒和超氧化物歧化酶試劑盒測定MDA含量(nmol/mg prot)和SOD活力(U/mg prot)。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理對DM小鼠生活狀態的影響

觀察DM小鼠每天的生活狀態(表1)。空白對照組小鼠毛色光亮,活動頻繁,模型組小鼠毛發枯黃,光澤度下降,精神萎靡,多尿;給予膠原蛋白肽交叉苦瓜素DM小鼠處理比陽性對照組小鼠毛色光澤度高,小鼠活動更為頻繁,墊料相對更為干燥。

表1 膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理對DM小鼠生活狀態的影響Table 1 Effect of collagen peptide intersecting Momordica charantia extracts treatment on life status of DM mice

2.2 膠原蛋白肽交叉苦瓜素對DM小鼠生長的影響

糖尿病小鼠模型建立成功后,給予膠原蛋白肽處理DM小鼠16 d(圖1),對照組小鼠體重隨時間呈現緩慢增加趨勢;模型組 DM 小鼠在前4 d體質量整體下降,由最初的24.87 g下降至23.97 g,無顯著性差異,隨后體重增加;陽性對照組小鼠體重增加,LGinterMCE組小鼠前4 d體重下降,隨后上升呈顯著性差異(p<0.05),其他組體重均上升。第16 d時TYPE-S處理組小鼠體重比陽性對照組略高0.5～2.4 g,比模型組低0.6～2.5 g。GBB-10SP處理組小鼠體重比陽性對照組略低。第16 d后給予苦瓜素處理,24 d后糖尿病小鼠體重變化不明顯,經過膠原蛋白肽交叉苦瓜素治療后糖尿病小鼠的體重趨向穩定,表明給藥處理后糖尿病損傷機體逐漸修復。

圖1 膠原蛋白肽和苦瓜素對DM小鼠體重的影響Fig.1 Effect of collagen peptide and Momordica charantia extracts on body weight of DM mice注:A:空白對照組;B:模型組;C:陽性對照組; D:LGinterMCE組;E:MGinterMCE組;F:HGinterMCE組; G:LTinterMCE組;H:MTinterMCE組; I:HTinterMCE組;圖2～圖3同。

經測定小鼠每天平均進食量如圖2所示,在灌胃膠原蛋白肽時期,空白組和DM小鼠在0～4 d進食量均下降,原因可能為血糖較高影響糖尿病小鼠進食。4～8 d后小鼠進食量平緩增加,12～16 d小鼠進食量劇增(除F組外)。在第16 d 時,LGinterMCE組、HGinterMCE組和MTinterMCE組小鼠進食量分別高于陽性對照組:2.5、4.83和1.8 g,且高于模型組,表明膠原蛋白處理組可調節糖尿病的進食,促進機體機能的修復,且效果由于陽性對照組。給予苦瓜素階段,DM小鼠進食量波浪型,與苦瓜素性味苦寒影響小鼠食欲有關。

圖2 膠原蛋白肽和苦瓜素對DM小鼠進食量的影響Fig.2 Effect of collagen peptide and Momordica charantia extracts on diet of DM mice

2.3 膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理對DM小鼠血糖的影響

檢測膠原蛋白肽處理階段和苦瓜素處理階段不同處理組的小鼠血糖值,結果見表2。

表2 膠原蛋白肽交叉苦瓜素對DM小鼠空腹血糖的影響(n=8)Table 2 Effect of collagen peptide intersecting Momordica charantia extracts on fasting blood glucose in diabetic mice(n=8)

與空白對照組相比,糖尿病小鼠血糖值顯著升高,且均高于11.1 mmol/L,但組間無明顯差異(p>0.05),表明造模成功。在膠原蛋白肽處理階段,LTinterMCE組、MTinterMCE組、HTinterMCE組血糖下降百分率為:21.95%、39.22%、39.69%,高于陽性對照組和GBB-10SP處理組。表明TYPE-S膠原蛋白肽降血糖效果優于GBB-10SP;在苦瓜素處理階段,LGinterMCE組、MGinterMCE組、HGinterMCE組苦瓜素處理血糖下降百分率31.77%、43.84%、25.63%優于GBB-10SP處理25.94%、20.73%、17.97%,表明對MGinterMCE、HTinterMCE組苦瓜素處理降血糖效果優于GBB-10SP與TYPE-S膠原蛋白肽。MGinterMCE組在苦瓜素處理階段降血糖顯著高于HTinterMCE組,可能是由膠原蛋白肽處理階段,過高劑量的膠原蛋白處理擾亂小鼠機體代謝水平,糖尿病機體損傷加重,后期用苦瓜素治療時,機體修復緩慢,作用效果弱于MGinterMCE組,而TYPE-S交叉苦瓜素組降血糖效果呈劑量關系,表明不同來源膠原蛋白肽降血糖作用具有差異性。

2.4 膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理對DM小鼠葡萄糖耐量的影響

檢測膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理21 d,對DM小鼠口服葡萄糖耐量結果見表3。

表3 膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理對DM小鼠糖耐量的影響(n=8)Table 3 Effects of collagen peptide intersecting Momordica charantia extracts treatment on glucose tolerance of DM mice(n=8)

在各組小鼠灌胃給予葡萄糖后,30 min血糖值相對于0 min血糖值急劇升高,經過120 min后血糖值有所降低。同正常組相比,模型組與給藥組的葡萄糖耐量下降趨勢平緩。在0、30、120 min時各給藥組小鼠血糖值均低于模型組小鼠,給藥組與模型組具有差異顯著性(p<0.05)。給藥組血糖值120 min后均恢復至灌胃前血糖值以下。MGinterMCE組、MTinterMCE組、HTinterMCE組、陽性組與模型組AUC分別為:32.03、32.45、32.87、36.28和61.78 mmol/(min·L),前四組和模型組相比具有顯著性差異(p<0.05),MGinterMCE組、MTinterMCE、HTinterMCE組與陽性組和模型組對比糖耐量曲線下面積減小。表明膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理能抑制糖尿病小鼠餐后血糖升高,并顯著增強糖尿病小鼠葡萄糖負荷糖耐量,推測出膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理可以修復糖尿病小鼠胰島β細胞損傷。

2.5 膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理對DM小鼠肝組織抗氧化能力的影響

膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理對DM小鼠肝組織的SOD活性及MDA含量檢測結果見表4。

表4 膠原蛋白肽交叉苦瓜素對DM小鼠肝組織抗氧化能力的影響(n=8)Table 4 Effect of collagen peptide intersecting Momordica charantia xtracts on antioxidant capacity of liver tissue of DM mice(n=8)

SOD酶能把過氧化物催化生成過氧化氫和氧氣,從而消除機體內的超氧陰離子。因超氧化物歧化酶是生物體內唯一能催化超氧化物歧化的生物酶,所以SOD酶活性已經作為評價藥物抗氧化能力的重要指標[12-13]。丙二醛的含量的多少直接反映了機體氧化損傷的程度[14-15]。

從表4中可以看出,模型組體內SOD活性57.63 U/mg prot低于對照組101.48 U/mg prot呈顯著性差異(p<0.05),而MDA7.39 nmol/mg prot高于對照組3.67 nmol/mg prot呈顯著性差異(p<0.05)。經膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理后,SOD活性均提高,MDA含量顯著降低,LGinterMCE組、MGinterMCE組、HGinterMCE組與陽性對照組SOD活性呈顯著性差異(p<0.05),MGinterMCE組SOD活性較高為154.72U/mg prot,MDA含量較低為1.66 nmol/mg prot,LGinterMCE組SOD活性顯著高于正常組,MDA 含量低于正常組,表明經LGinterMCE組處理后促進鼠機內肝組織修復和提高抗氧化作用顯著,HGinterMCE組SOD活性較低與前面過高劑量的膠原蛋白肽無降血糖作用一致,可能是過高劑量使機體代謝失衡,肝組織損傷導致。LTinterMCE組、MTinterMCE組、HTinterMCE組SOD活性高于陽性組呈顯著性,MDA含量均低于陽性組呈顯著性差異(p<0.05)。表明膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理可提高糖尿病小鼠肝組織的抗氧化能力,推測出膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理對糖尿病小鼠肝臟損傷具有能力。

2.6 膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理對DM小鼠臟器指數的影響

膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理對DM小鼠肝臟、腎臟、脾臟指數測定結果見表5。

表5 膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理對DM小鼠臟器指數的影響(n=8)Table 5 Effect of collagen peptide intersecting Momordica charantia extracts treatment on organ index of DM mice(n=8)

經解剖觀察,模型組小鼠的肝臟和腎臟器官明顯腫脹,脾臟器官萎縮,測定肝臟指數、腎臟指數高于對照組呈顯著差異(p<0.05),脾臟指數低于對照組,表明DM小鼠的臟器功能顯著下降。膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理后,DM小鼠肝臟指數、腎臟指數降低,脾臟指數升高具有統計學意義。MGinterMCE組、MTinterMCE組、HTinterMCE組的肝臟指數為51.82、44.98、48.49 mg/g,腎臟指數為:12.15、11.29、11.54 mg/g,低于陽性組,脾臟指數為2.96、3.18、2.98 mg/g與陽性組相當。表明MGinterMCE組、MTinterMCE組、HTinterMCE組對DM小鼠肝臟和腎臟器官具有修復和保護作用,對脾臟具有促進生長作用,且效果顯著。

3 結論與討論

膠原蛋白肽易被腸道直接吸收,能提供機體需要的營養物質,還具有避免機體損傷造成的蛋白分解、糖、脂代謝紊亂,體重急劇下降等癥狀[16]。富含膠原蛋白肽的營養制劑可防治營養缺乏,增強應答功能,維持正常、適度的免疫反應,減輕有害的或過度的炎癥反應,即膠原蛋白肽密切關聯著免疫營養[17]。苦瓜提取物使Ⅱ型糖尿病受損的胰島素β細胞恢復正常的分泌功能,增強胰島素抵抗降低大鼠的空腹血糖,且血糖正常后保持穩定持久[18-20],因此本實驗采用膠原蛋白肽改善機體免疫和營養代謝特性后,交叉苦瓜素輔助降低小鼠血糖下降,實現營養代謝改善后調節血糖的目標。

膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理DM 4周后能明顯降低血糖水平,空腹血糖降到7.5～16.63 mmol/L,其中MGinterMCE組、MTinterMCE組、HTinterMCE組血糖恢復到8.6 mmol/L以下,降血糖效果顯著(p<0.05),且糖尿病小鼠血糖曲線下面積明顯減少,改善糖尿病小鼠糖耐量異常。但HGinterMCE組血糖值在灌胃膠原蛋白肽處理時,血糖值上升,而灌胃苦瓜素處理后略有下降。推測膠原蛋白肽灌胃量過高造成調節失衡而無降血糖作用,并且不同膠原蛋白肽的功效存在差異。這需要后續實驗繼續研究。

四氧嘧啶通過破壞胰島β細胞,引起血糖升高,造成實驗性糖尿病[21-22]。四氧嘧啶破壞β細胞產生氧自由基,使SOD活力降低等,引起糖尿病人和糖尿病動物模型的抗氧化能力均下降[23]。膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理DM 4周后,血糖含量降低的同時肝組織抗氧化能力提高,MGinterMCE組、MTinterMCE組、HTinterMCE組顯著提高肝SOD活力,降低肝MDA含量。

MGinterMCE組、MTinterMCE組、HTinterMCE組處理組與模型組相比較,肝臟和腎臟的指數降低,脾臟指數顯著提高。膠原蛋白肽交叉苦瓜素降低血糖和提高DM小鼠肝組織抗氧化能力的同時,改善肝臟和腎臟的損傷和促進修復。基于研究結論認為,膠原蛋白肽交叉苦瓜素處理,能增強自身免疫,恢復胰島β細胞功能,促進胰島素分泌,調節血糖趨于正常水平,減輕機體糖尿病癥狀。

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