墨西哥黃唇魚魚肉膠原肽促進小鼠傷口愈合作用

來夢婕,陳玉峰,張 英,楚秉泉

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江省農產品加工技術研究重點實驗室,浙江省食品加工技術與裝備工程研究中心,浙江杭州 310058)

傷口愈合是由多種細胞、細胞因子參與的復雜且耗能的過程[1]。營養不良與飲食攝入不足可顯著延緩一般性手術及慢性傷口的恢復。傷口愈合時,為了維持自身內環境穩定,機體會產生局部或全身性炎癥反應,導致基礎代謝率增高,能量消耗增加,機體易出現負氮平衡[2]。負氮平衡的持續加劇將直接導致體內蛋白質的大量流失。Kumar等[3]發現膠原蛋白作為細胞外基質重要組成成分,外敷可促進傷口愈合,如Chikazu等[4]研究證明深海膠原蛋白凝膠敷料對糖尿病小鼠切除型傷口愈合非常有用,Zhang等[5]發現口服鮭魚皮肽具有促進創傷型大鼠傷口愈合的潛力。

加利福尼亞灣石首魚(Totoabamacdonaldi),又稱麥氏托頭石首魚、加州犬型黃花魚,屬硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科,其最大可長至2 m重至100 kg,或者更甚,是該科最大型的海洋魚類,為墨西哥加利福尼亞灣的特有魚種[6]。其魚鰾與中國黃唇魚(Bahabaflavolabiata)的魚鰾形態相似且名貴[7],加灣石首魚也因此被稱為“墨西哥黃唇魚”。自上世紀60年代以來,因過度捕撈及棲息地生態變化,自然資源頻臨衰竭[6]。自然捕獲的墨西哥黃唇魚基本停留在“殺魚取鰾”的原始階段,由于其魚肉口感粗糙,經濟價值不高,常被直接丟回大海,造成水域污染和資源浪費。近年來,隨著人工繁殖和增殖放流技術的突破,養殖墨西哥黃唇魚取鰾后魚體的綜合利用和高值轉化受到關注。

本研究以墨西哥黃唇魚肉為原料,利用復合酶法首次制得口服易吸收的寡肽,運用小鼠皮膚創傷模型,探索其對傷口愈合的促進作用，以期開發一種能夠顯著促進傷口愈合的高品質口服膠原肽功能食材,為取鰾后墨西哥黃唇魚肉的高值轉化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

墨西哥黃唇魚凍品 浙江黃唇漁生物科技有限公司;堿性蛋白酶(10萬IU)、復合風味蛋白酶(1.4萬IU) Novozymes公司;L-甲硫氨酸(純度>99%)、核糖核酸酶A(純度>99%) Sigma公司;成骨生長肽(純度>97%)、胸腺五肽(純度>90%) 杭州中肽生物有限公司;雄性ICR小鼠SPF級,體重(25±2) g,合格證號SCXK(滬)2012-0005 上海斯萊克實驗動物有限責任公司;羥脯氨酸試劑盒 南京建成科技有限公司;VEGF多克隆抗體、兔抗bFGF和HRP-山羊抗兔二抗 Servicebio公司。

JYL-C022E型多功能料理機 九陽股份有限公司;HHS21-Ni6型電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠;LGJ-200F型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;L-8900型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司;208型凝膠滲透色譜儀 WATERS公司;RM2016型病理切片機 上海徠卡儀器有限公司;722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;NIKON ECLIPSE TI-SR型倒置熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 墨西哥黃唇魚肉膠原肽(TMCP)的制備 冷凍的魚體解凍后用流水洗凈,絞碎制成魚糜,密封袋分裝,冰凍備用。根據王巖等[8]利用雙酶法制備鰱魚水解肽的工藝參數及前期實驗優化,制備步驟如下:將魚糜分散于蒸餾水中,料∶水比為 1∶2 (g/mL),加熱至50 ℃后,調節pH為7.0,加入1.0%的復合酶(堿性蛋白酶∶復合風味蛋白酶=1∶2),酶解時間為4 h,待反應結束后,至沸水浴中加熱20 min使酶失活,然后將酶解液在10000 r/min下離心10 min,取上清液,冷凍干燥,制得TMCP 凍干粉。

1.2.2 TMCP的氨基酸組成分析 根據 GB/T 5009.124-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》[9]方法進行TMCP的前處理,氨基酸分析儀測定其氨基酸種類及含量。

1.2.3 TMCP的分子量分布測定 采用Waters凝膠色譜系統測定TMCP的分子量分布范圍,色譜條件為:凝膠柱:TOSOH TSK gel G2000 SWXL(7.8 mm×30 cm),波長:220 nm;流動相:乙腈-水-三氟乙酸(三者體積比10∶90∶0.1);進樣量:40 μL;柱溫:40 ℃;流速:0.6 mL/min[10]。

1.2.4 小鼠皮膚創傷模型的構建 實驗小鼠經1%戊巴比妥鈉麻醉后,剃去背毛,經常規皮膚消毒,在脊柱中部左右兩側相同位置蓋上圓形印章(直徑為8.0 mm),無菌條件下用手術剪沿印記邊緣剪去皮膚,制造出圓形全層皮膚傷口。造模后進行單籠飼養,并將造模當天記為第0 d。

1.2.5 動物分組與實驗 取40只體重為(25±2) g的小鼠,隨機分為4組,每組10只,分別為空白對照組、膠原肽低劑量組(TMCP_L,0.66 g/kg·bw)、中劑量組(TMCP_M,1.33 g/kg·bw)、高劑量組(TMCP_H,2.0 g/kg·bw)。空白對照組給予等體積溶劑(去離子水)灌胃。術后次日起,每日灌胃。分別于造模后的第7 d和第14 d分批處死動物(每組每批各5只)。每次處死后的小鼠分別切取其左右兩側傷口邊緣3.0 mm的全層皮膚組織,右側固定于4%多聚甲醛24 h以上,制成石蠟切片,用于HE染色分析、Masson染色分析和免疫組織化學染色分析;左側用于測定羥脯氨酸含量。造模及取樣部位見圖1。

圖1 小鼠皮膚創傷模型示意圖Fig.1 Sketch map of the wound healing in mice

1.2.6 傷口愈合率測定 每日觀察傷口變化情況,每隔2 d給小鼠傷口拍照,采用毫米方格坐標紙記數法計算小鼠的傷口面積,觀察時間為0～14 d。傷口完全愈合即創面完全上皮化的標準:愈合面積大于原始傷口面積的95%(即傷口面積小于原始傷口面積的5%)[11]。

傷口愈合率(%)=(初始創面面積-未愈合創面面積)/初始創面面積×100

1.2.7 傷口組織病理學分析(HE染色) 將1.2.5中制得的組織切片用甲苯-無水酒精脫去石蠟,然后經過100%、70%、50%、20%、0%的乙醇洗滌,切片入Harris蘇木素染3～8 min,自來水洗,1%的鹽酸乙醇(70%乙醇做溶劑)分化數秒,自來水沖洗,0.6%氨水返藍,流水沖洗。切片入伊紅染液中染色1～3 min。脫水封片后在顯微鏡下觀察傷口愈合過程中的病理變化。

1.2.8 膠原含量分析(Masson染色) 將1.2.5中制得的組織切片同1.2.7步驟做脫蠟處理。用weigert鐵蘇木素染料(weigert鐵蘇木素A、B液等比例混和)染5～10 min,流水稍洗。1%鹽酸酒精分化,流水沖洗數分鐘。麗春紅酸性品紅染液染5～10 min,流水稍沖洗。磷鉬酸溶液處理約5 min,不用水洗,直接用苯胺藍染液復染15 min。1%冰醋酸處理30 s,95%酒精脫水多次。無水酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。在顯微鏡下觀察傷口愈合過程中膠原沉積的變化,膠原纖維呈藍色,肌纖維、纖維素呈紫紅色。每個樣本隨機找5個不同的視野拍攝照片,使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算膠原含量。

1.2.9 傷口組織的羥脯氨酸含量測定 作為膠原蛋白特異性的基本成分,羥脯氨酸的含量可以作為傷口組織中膠原含量的重要指標[12]。依據羥脯氨酸試劑盒(堿水解法)操作方法,組織水解后調節pH為6.5,加入20 mg活性炭,混勻,在3500 r/min下離心10 min,取上清液1 mL,與檢測液按要求混勻,3500 r/min下離心10 min,取上清液,550 nm處測定吸光度,計算羥脯氨酸含量。

羥脯氨酸含量(μg/mg濕重)=(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品含量(5 μg/mL)×水解液總體積(10 mL)/組織濕重(mg)

1.2.10 免疫組織化學染色法分析 1.2.5中制得的組織切片經抗原修復和血清封閉后,在切片上滴加VEGF多克隆抗體(稀釋度1∶200)和兔抗bFGF(稀釋度1∶300),4 ℃過夜,次日滴加山羊抗兔二抗(稀釋度1∶200)及抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復合物,DAB顯色,蘇木素復染,陽性細胞呈棕黃色。每組內每張切片隨機挑選3個400倍視野進行拍照,拍照時盡量讓組織充滿整個視野,保證每張照片的背景光一致[13]。應用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統一標準,分析得出每張照片陽性的積分光密度值(Integrated Optical Density,IOD)。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 墨西哥黃唇魚膠原肽(TMCP)的氨基酸組成分析

從TMCP中檢測出22種氨基酸,包括8種必需氨基酸、2種半必需氨基酸、8種非必需氨基酸和4種特殊氨基酸,氨基酸組成較為全面。根據表1,TMCP中必需氨基酸占氨基酸總量的比值(WEAA/WTAA)為40.04%,必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(WEAA/WNEAA)為81.91%。根據FAO/WHO的理想模式,質量較好的蛋白質其組成氨基酸的WEAA/WTAA為40%左右,WEAA/WNEAA在60%以上[14]。因此,TMCP的氨基酸組成符合FAO/WHO評價標準,為營養價值較高的優質蛋白源。

表1 TMCP的氨基酸組成及含量Table 1 Amino acids composition and contents of TMCP

在TMCP的氨基酸測定中檢出了4種特殊氨基酸,且具有相當高的含量(牛磺酸0.74%、γ-氨基丁酸1.03%、鳥氨酸0.37%、羥脯氨酸1.24%)。牛磺酸在腦神經細胞發育過程中起重要作用;γ-氨基丁酸在臨床上主要用于降血壓及恢復腦細胞功能;鳥氨酸參與體內氨態氮的排出和尿素形成;羥脯氨酸在許多蛋白質中含量很低或沒有,但是膠原蛋白的主要組成部分,占了25%以上[7]:與區又君等[7]報道的野生黃唇魚鰾中的氨基酸組成相類似,推測其肌肉及其水解物也應具有與魚鰾相似的保健功能和藥用價值。

2.2 TMCP的分子量分布

凝膠色譜系統分析結果見圖2,經堿性蛋白酶與復合風味蛋白酶酶解得到的TMCP峰形良好,分散度小,分子量均一,測定得其平均分子量(Mw)為837 Da,是約由5～8個氨基酸組成的寡肽。張寧等[15]通過胃炎大鼠模型發現膠原肽平均分子量1 kDa的吸收率>3 kDa的吸收率>20 kDa的吸收率,推測平均分子量837 Da寡肽受胃消化過程影響小,可通過運載體直接進入血液,吸收速度快。本文采用獨特的酶解技術制備得到的TMCP寡肽分子量小于1 kDa,極易被人體吸收。

圖2 TMCP分子量測定的凝膠色譜圖Fig.2 Results from gel permeation chromatography measurement

2.3 TMCP對小鼠傷口愈合率的影響

由圖3可知,隨著造模后愈合時間的增加,各組小鼠的創面面積均逐漸減小,傷口愈合率隨之升高。造模后第4 d起,TMCP處理組的傷口愈合率均高于空白對照組,并在造模后的第2、4、6 d,呈現出一定的劑量依賴關系,且低(0.66 g/kg)劑量從第4 d起即已表現出極好的促進愈合作用;在造模后第2周,TMCP處理組間的傷口愈合率無顯著差異,在造模后第14 d均完全愈合(傷口愈合率達到95%),與空白對照組存在極顯著差異(p<0.01)。造模后第6 d,TMCP處理組的傷口愈合率極顯著高于空白對照組(p<0.01)。說明TMCP可以加速傷口愈合,尤其是在愈合前期表現出極好的促進效果。

圖3 TMCP對小鼠傷口愈合的影響Fig.3 The effect of TMCP on the wound healing of mice

2.4 TMCP對小鼠皮膚傷口組織病理變化的影響

傷口愈合是一個復雜的生物學過程,有多種細胞和組織成分參與,包括成纖維細胞增殖、膠原分泌、新生血管生成、表皮細胞增殖和傷口的上皮化等[1]。TMCP對小鼠傷口組織病理變化的影響見圖4。造模后第7 d,空白對照組小鼠皮膚傷口組織中有大量炎癥細胞浸潤(炎癥細胞在反應灶聚集,多為核圓形,著色深),少量新生血管(多為卵圓形,多在創面處),表皮組織尚未形成;TMCP_L組傷口組織中有較多炎癥細胞浸潤,新生血管豐富,少量成纖維細胞(多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構)[16]開始分泌膠原纖維;TMCP_M組傷口組織中有少量炎癥細胞,少量成纖維細胞,大量膠原纖維生成,表皮組織逐漸形成;TMCP_H組傷口組織中有少量炎癥細胞,較多成纖維細胞,大量膠原纖維生成,并有毛囊等皮膚附屬器產生,表皮組織逐漸形成。

圖4 造模后第7 d小鼠皮膚傷口組織病理切片觀察(HE,×100)Fig.4 Representative micrographs of H&E stained wound tissues in mice at day 7(HE,×100)注:a為空白對照組;b為TMCP_L組;c為TMCP_M; d為TMCP_H組;I為炎癥細胞;V為血管; F為成纖維細胞;E為表皮。

如圖5,造模后第14 d,空白對照組仍有較多炎癥細胞浸潤,肉芽組織(初始階段的纖維結締組織)[16]新鮮,新生較多膠原纖維;TMCP_L組有少量炎癥細胞浸潤,成纖維細胞生成大量膠原纖維,表皮組織基本形成;其余兩組基本無炎性滲出物,大量成纖維細胞和膠原纖維出現,且膠原纖維排列有序,肉芽組織較對照組成熟,創口邊緣均有較厚的新生表皮。

圖5 造模后第14 d小鼠皮膚傷口組織病理切片觀察(HE,100×)Fig.5 Representative micrographs of H&E stained wound tissues in mice at day 14(HE,×100)注:A為空白對照組;B為TMCP_L組;C為TMCP_M組; D為TMCP_H組;I為炎癥細胞; V為血管;F為成纖維細胞;E為表皮。

組織病理學分析結果表明,中、高劑量組的TMCP能夠趨化誘導炎癥細胞,刺激成纖維細胞增殖和分化并伴隨新的毛細血管和表皮組織的生長,表明TMCP可以促進上皮組織重塑過程。

2.5 TMCP對小鼠傷口組織中膠原含量的影響

TMCP對小鼠皮膚傷口組織中膠原含量的影響如表2所示。隨著造模后天數的增加,各組中膠原纖維均逐漸增多。造模后第7、14 d,TMCP處理組膠原含量與空白對照組相比均有極顯著差異(p<0.01);且TMCP三個劑量組間也存在顯著差異(p<0.05),膠原含量呈現劑量依賴關系。傷口愈合過程中,纖維細胞通過沉積和降解膠原蛋白分子,使膠原纖維有序排列重構膠原化的真皮結構[17]。曾有文獻[18]報道,在體外NIH/3T3成纖維細胞模型中,刺參多肽能顯著提高I型膠原的分泌量。

表2 TMCP對小鼠傷口組織中膠原含量的影響Table 2 The effect of TMCP on the collagen content in wound tissue

2.6 TMCP對小鼠傷口組織中羥脯氨酸含量的影響

由于羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4%,是膠原蛋白特征性成份之一[19],因此可以通過檢測羥脯氨酸的含量進一步反映膠原蛋白的量。TMCP對小鼠傷口愈合過程中羥脯氨酸含量的影響見表3。可知,隨著愈合天數的增加,傷口組織中的羥脯氨酸含量也隨之增加。第7、14 d時,TMCP_M組與TMCP_H組傷口組織中的羥脯氨酸含量差異不顯著(p>0.05),但均極顯著高于空白對照組(p<0.01)。第14 d時,TMCP_L組與TMCP_M組傷口組織中的羥脯氨酸含量差異不顯著(p>0.05),但均高于空白對照組。這與半定量分析膠原含量的結果較一致。

表3 TMCP對小鼠傷口組織中羥脯氨酸含量的影響Table 3 The effect of TMCP on the Hydroxyproline content in wound tissue

2.7 免疫組織化學染色分析結果

2.7.1 TMCP對小鼠皮膚傷口組織中VEGF表達的影響 血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)[20]是目前研究發現功能最強大、作用范圍最廣的促血管生成因子,能夠促進血管內皮細胞增殖、分化、遷移,從而促進新生血管形成[21]。TMCP對小鼠傷口組織中VEGF表達的影響見表4、圖6,隨著造模后天數的增加,傷口組織中的VEGF表達量呈增加趨勢。造模后第7、14 d,TMCP處理組中VEGF表達均極顯著高于對照組(p<0.01),且在愈合前期,TMCP處理組的VEGF表達量約兩倍于空白對照組。實驗表明,TMCP在傷口愈合前期對VEGF的表達具有極其顯著的促進作用,這與王毅等[22]、Lee等[23]對創傷愈合中VEGF表達的生物動力學變化的研究結果一致。

表4 TMCP對小鼠傷口組織中VEGF表達的影響Table 4 The effect of TMCP on the expression of VEGF in wound tissue

圖6 TMCP對小鼠傷口組織中VEGF表達的影響(400×)Fig.6 The effect of TMCP on the expression of VEGF in wound tissue(400×)注:圖中箭頭所指的棕黃色顆粒為陽性信號;圖7同。

2.7.2 TMCP對小鼠皮膚傷口組織中bFGF表達的影響 傷口創面中堿性成纖維細胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)的高表達,有助于傷口愈合過程中肉芽組織的增生[24]。TMCP對小鼠傷口組織中bFGF表達的影響見表5、圖7,隨著造模后天數的增加,傷口組織中的bFGF表達量呈增加趨勢。造模后第7 d,TMCP_L組中bFGF表達顯著高于空白對照組(p<0.05),中、高劑量組極顯著高于對照組(p<0.01)。造模第14 d,對照組及TMCP_L組的bFGF表達量均上升,而中、高劑量組的表達量小幅上漲。從實驗結果來看,TMCP在整個傷口愈合期對bFGF的表達均有促進作用,Sadanori等[25]發現在早期損傷階段bFGF可通過激活ERK通路誘導成纖維細胞增殖與DNA合成,這與TMCP中、高劑量組成纖維細胞在愈合前期大量生成的結果相近。

表5 TMCP對小鼠傷口組織中bFGF表達的影響Table 5 The effect of TMCP on the expression of bFGF in wound tissue

圖7 TMCP對小鼠傷口組織中bFGF表達的影響(400×)Fig.7 The effect of TMCP on the expression of bFGF in wound tissue(400×)

因此推測,TMCP通過提高bFGF和VEGF的表達從而加快細胞增殖和血管生成,是其促進小鼠傷口愈合的機制之一。

3 結論與討論

本研究經復合酶解處理墨西哥黃唇魚肉,得到數均分子量為837 Da的寡肽(TMCP),氨基酸組成分析為營養價值較高的優質蛋白源,其中有相當高含量的牛磺酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸和羥脯氨酸。利用小鼠傷口愈合模型,結合傷口愈合率、病理組織切片觀察、膠原及羥脯氨酸含量測定和bFGF、VEGF生長因子表達等指標,TMCP在所試劑量(0.66～2.0 g/kg)范圍內都表現出良好的促進小鼠皮膚傷口愈合的作用,并在造模后的第一周內表現出一定的劑量依賴關系,初步探索表明墨西哥黃唇魚膠原肽(TMCP)對促進傷口恢復有極大潛力。從全過程綜合指標分析來看,中劑量與高劑量的效果相當。后續新產品研發中的整體動物實驗建議參照TMCP中劑量水平(1.33 g/kg)來優化產品組方及進行相關的生物學效應和作用機制研究。

近年如何促進傷口愈合速度并提高愈合質量一直是研究的熱點。目前,相當一部分難愈合慢性創傷或潰瘍多繼發于糖尿病和老年病等,這可能與患者皮膚的特殊微環境和體內免疫應答功能障礙有關[26]。糖尿病患者體內高糖環境更會不斷促進炎癥反應的發生,約有25%的糖尿病患者終生伴有糖尿病足部潰瘍,其中,20%的患者由于不當的治療或護理導致嚴重潰爛感染而被迫截肢[27]。TMCP的氨基酸組成含量豐富,特別是其含有4種極具藥用價值的特種氨基酸,可期望用于調節免疫應答及改善體內微環境。因此,TMCP對慢性難愈創面的輔助治療作用有待進一步研究。此外,由于口服營養品需要消化吸收時間,為了縮短傷口出血和凝血時間,臨床上需要與敷料配合使用,這也為墨西哥黃唇魚加工副產物魚鱗、魚皮等開發提供了思路。隨著對墨西哥黃唇魚研究的不斷深入,其在醫藥及保健領域的應用會越來越廣泛。

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