植物乳桿菌SCS2不同受試物對小鼠血糖及氧化應激的影響

孟 曉,蔣麗施,陳 艷,劉蜀坤

(成都中醫藥大學公共衛生學院,四川成都 611137)

乳酸菌作為公認安全(GRAS)的食品級微生物,具有幾乎無毒副作用、性質穩定溫和、效果明顯持久的特點,且兼具緩解乳糖不耐癥、治療腹瀉、調節宿主的腸道菌群、抑制腸道中促癌酶活性、免疫調節等多種生理活性和有益功能,已成為相關領域研究人員關注的熱點[1-3]。值得關注的,國內外研究者觀察到乳酸菌作為一種安全有效的生物效應調節劑,還具有改善氧化應激的作用[4-7]。而氧化應激已被證實是以高血糖水平為特征的Ⅱ型糖尿病進程中起關鍵作用的致病因素[8]。

有研究結果顯示,與模型組相比,低劑量(108CFU/mL)植物乳桿菌NCU116(LactobacillusplantarumNCU116)能夠顯著降低糖尿病(雄性Wistar)大鼠的血糖水平,其血清中過氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)的活性顯著提高,丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量顯著降低[4]。此外,Ejtahed等[5]通過讓高血糖患者食用含有嗜酸乳桿菌La5(LactobacillusacidophilusLa5)和雙歧桿菌Bb12(BifidobacteriumBb12)的酸奶6周,發現與食用普通酸奶的患者相比,其空腹血糖水平均顯著下降,機體紅細胞中SOD和GSH-Px活性以及總抗氧化能力顯著提高,而血清中MDA含量也顯著低于所有受試對象的平均水平。同樣的,也有研究發現,低劑量(2.0×108CFU/mL)干酪乳桿菌Zhang(LactobacilluscaseiZhang)可以改善高脂膳食動物(雄性Wistar大鼠)的氧化應激水平,提高其血清和肝臟中SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性,降低MDA水平[6]。上述研究結果均提示乳酸菌在改善機體氧化應激水平方面表現出積極的作用,但目前仍不能明確乳酸菌改善氧化應激的功能組分及其作用機制。

在前期研究中已經證實來源于發酵香腸的1株植物乳桿菌(LactobacillusplantarumSCS2,L.plantarumSCS2)能夠顯著降低STZ誘導的高血糖模型小鼠血糖水平,提高其葡萄糖耐受能力;同時,還能夠改善由于高血糖引起的如小鼠體重減輕、血漿中K+丟失,Na+和Cl-含量升高以及肝糖原含量升高等問題[9]。但其發揮作用的關鍵因子及其與氧化應激的關系尚不清楚。因此,本文以鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)結合高脂高糖飼料誘導的高血糖模型小鼠為研究對象,L.plantarumSCS2發酵液上清液、菌體懸浮液和細胞內容物懸浮液為受試物,研究灌胃不同受試物對實驗小鼠體重、空腹和餐后2 h血糖、葡萄糖耐受能力、血清中MDA含量和SOD、GSH、GSH-Px活性等指標的影響,并分析L.plantarumSCS2降血糖作用的關鍵因子及其與氧化應激的關系,為進一步研究L.plantarumSCS2的降血糖作用機制提供理論基礎和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.plantarumSCS2 分離自四川發酵香腸,成都中醫藥大學公共衛生學院實驗中心保藏;4周齡SPF級KM雄性小鼠[SCXK(川)2015-030]、基礎飼料和高糖高脂飼料 四川成都達碩實驗動物有限公司;STZ 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;MRS(De Mann,Rogosa and Sharpe)培養基、氯化鈉等 均為分析純,四川成都科龍化工試劑廠;MDA和SOD酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒 上海遠慕生物科技有限公司;GSH和GSH-Px ELISA試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司。

HH·B11-BS-Ⅱ型電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器 致微(廈門)儀器有限公司;SW-CJ-2FD型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;血糖儀 勤立生物科技股份有限公司;H2050R-1型高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;YCD-EL200型冰箱 中科美菱低溫科技有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同受試物的制備 取斜面保存L.plantarumSCS2菌株,加入5 mL、0.85%滅菌生理鹽水,振搖混勻制成菌懸液,以1%接種量(V∶V)接種于MRS液體培養基,在36 ℃條件下培養18 h,用0.85%滅菌生理鹽水調整菌懸液濃度為108CFU/mL。將上述發酵液離心處理5 min(3000×g,5 ℃),收集上清液備用;沉淀菌體用0.85%滅菌生理鹽水制成菌體懸浮液備用。采用上述方法重新獲取相同濃度菌體懸浮液,在冰浴條件下超聲間歇處理(超聲功率400 W,時間間隔5 s)30 min,3000×g,5 ℃ 離心5 min,收集上清液作為細胞內容物備用[10-11]。

1.2.2 實驗分組和高血糖模型小鼠的建立 60只4周齡SPF級雄性KM小鼠用完全隨機法分為5組,即普通組(NG)、模型組(MG)、菌懸液組(TG1)、發酵液上清液組(TG2)和內容物組(TG3)。實驗小鼠以基礎飼料適應性喂養3周后,MG、TG1、TG2和TG3組小鼠禁食不禁水12 h,采用70 mg/kg bw STZ連續3 d進行腹腔注射,造模期間投喂高脂高糖飼料,持續1周[12-13]。1周后測定小鼠體重與血糖水平,空腹血糖水平≥7.0 mmol/L,餐后2 h血糖水平≥11.0 mmol/L為造模成功[14-15]。TG1、TG2、TG3組小鼠從第5周開始分別灌胃濃度為108CFU/mL的L.plantarumSCS2菌懸液、發酵液上清液和細胞內容物。NG和MG組小鼠從實驗開始灌胃滅菌生理鹽水,直至第9周實驗結束。其中,滅菌生理鹽水、菌懸液、發酵液上清液和細胞內容物灌胃量均為10 mL/kg bw[4]。

1.2.3 血糖水平測定 第3周開始至結束期間每周測定一次空腹與餐后2 h血糖。測定血糖之前小鼠禁食不禁水12 h,采取尾部血液測定其空腹血糖值;投喂食物之后2 h采取小鼠尾部血液,用血糖儀測定其餐后2 h血糖值。

1.2.4 葡萄糖耐受能力測定 小鼠造模成功后第7 d和實驗結束前(第9周),對各組每只小鼠進行口服葡萄糖耐受量測定。測定前小鼠禁食不禁水12 h,以2 g/kg bw葡萄糖溶液對實驗小鼠進行腹腔注射,測定其0、15、30、60、90、120 min時的血糖水平,繪制葡萄糖耐受量變化曲線[16],計算各組小鼠2 h血糖值的曲線下面積(area under curve,AUC)。

1.2.5 血清中MDA、SOD、GSH和GHS-Px水平測定 實驗結束后,采用摘眼球取血法采集實驗小鼠血樣,離心10 min(3000×g,4 ℃),取血清,采用ELISA試劑盒和酶標儀檢測實驗小鼠血清中MDA、SOD、GSH和GHS-Px水平。

1.3 數據處理

數據均采用SPSS 22.0統計軟件(IBM SPSS公司)進行單因素方差分析(Tukey法),p<0.05表示具有統計學意義。實驗結果以平均值±標準差形式表示。

2 結果與分析

2.1 L. plantarum SCS2不同受試物對實驗小鼠體重的影響

由圖1可以看出,除NG小鼠外,MG、TG1、TG2和TG3小鼠在造模成功后(第4周～第5周)體重均呈現下降趨勢。但TG1和TG3小鼠體重在第6周后有所上升,其中TG1小鼠體重上升不顯著(p>0.05),而TG3小鼠體重上升趨勢顯著(p<0.05)。在第9周時TG3小鼠體重已達到(37.2±2.0) g,但MG和TG2小鼠體重則顯著(p<0.05)下降。該結果表明L.plantarumSCS2細胞內容物能夠顯著緩解高血糖模型小鼠體重減輕的病癥。

圖1 實驗小鼠體重變化Fig.1 Change of body weight in mice

2.2 L. plantarum SCS2不同受試物對實驗小鼠血糖水平的影響

從圖2可以看出,除NG組小鼠外,MG、TG1、TG2和TG3小鼠的空腹血糖水平在造模成功后(第4周)均迅速上升,經過了2周的不同受試物灌胃后,從第6周開始TG1和TG3小鼠空腹血糖值均有所下降,其中TG1小鼠空腹血糖值下降不顯著(p>0.05),TG3小鼠空腹血糖值下降顯著(p<0.05),當實驗結束時,TG3小鼠空腹血糖值為(9.2±1.4) mmol/L,而MG和TG2小鼠空腹血糖值則顯著上升(p<0.05)。該結果表明L.plantarumSCS2細胞內容物能夠有效降低高血糖模型小鼠的空腹血糖。

圖2 實驗小鼠空腹血糖水平變化Fig.2 Change of fasting blood glucose in mice

從圖3可以看出,除NG小鼠外,造模成功后,MG、TG1、TG2和TG3小鼠的餐后2 h血糖值均快速上升。經過2周灌胃后,從第6周開始,TG3小鼠餐后2 h血糖值顯著下降(p<0.05),實驗結束時為(11.6±1.1) mmol/L,而TG1和TG2小鼠餐后2 h血糖值無顯著下降(p>0.05)。該結果表明L.plantarumSCS2細胞內容物對高血糖模型小鼠在餐后2 h血糖升高的癥狀有改善作用。

圖3 實驗小鼠餐后2 h血糖水平變化Fig.3 Change of 2 h postprandial blood glucose in mice

2.3 L. plantarum SCS2不同受試物對實驗小鼠口服葡萄糖耐受能力的影響

從圖4A可以看出,經過120 min后,除NG小鼠外，其作各組小鼠血糖水平仍未恢復到正常水平。從圖4B也可以看出,MG、TG1、TG2和TG3小鼠的2 h血糖AUC值顯著高于NG小鼠(p<0.05),且上述四組小鼠的2 h血糖AUC值無顯著差異(p>0.05),說明MG、TG1、TG2和TG3小鼠的葡萄糖耐受能力降低。而從圖5A可以看出,經過第5周的灌胃實驗后,各組小鼠口服葡萄糖15 min后,其血糖水平均處于最高值,但隨著時間的延長,TG1和TG3小鼠血糖水平開始下降,特別是TG3小鼠血糖水平下降趨勢顯著(p<0.05),當120 min時其血糖值為(8.7±1.3) mmol/L。同樣,從圖5B中可以看出,與MG小鼠相比,TG3小鼠的2 h血糖AUC值有顯著降低趨勢(p<0.05)。該結果表明L.plantarumSCS2細胞內容物能夠改善高血糖模型小鼠的葡萄糖耐受能力。

圖4 造模成功后第7 d實驗小鼠的口服葡萄糖耐受能力及2 h血糖值AUCFig.4 Oral glucose tolerance of mice on the seventh day after modeling and AUC of blood glucose in 2 h注:A為造模成功后第7 d不同受試物對實驗小鼠口服葡萄糖耐受能力的影響,B為造模成功后第7 d不同實驗組小鼠2 h血糖值的AUC;B中不同字母表示各數據間有顯著差異(p<0.05)。

圖5 實驗第9周實驗小鼠口服葡萄糖耐受能力及2 h血糖值AUCFig.5 Oral glucose tolerance of mice at the ninth week and AUC of blood glucose in 2 h注:A為實驗第9周不同受試物對實驗小鼠口服葡萄糖耐受能力的影響,B為實驗第9周不同實驗組小鼠2 h血糖值的AUC;B中不同字母表示各數據間有顯著差異(p<0.05)。

從上述結果可以看出,經過第5周的灌胃實驗,不同灌胃組實驗小鼠之間在體重、血糖水平和葡萄糖耐受能力等方面均表現出顯著差異。與MG小鼠相比,TG3小鼠的體重、空腹和餐后2 h血糖水平以及葡萄糖耐受能力均有顯著改善(p<0.05),該結果與前期研究結果基本相符[9],這可能是由于L.plantarumSCS2自身能夠產生一些具有特定生物活性的物質,如SOD、GPX、過氧化氫酶、金屬硫蛋白等,有利于其為宿主提供必需氨基酸、維生素,礦物元素等營養物質,從而控制體內葡萄糖代謝過程中相關產物的分解與合成,使得機體的血糖平衡得以維持[3];TG1小鼠的體重、空腹血糖水平以及葡萄糖耐受能力雖有所改善,但與MG小鼠相比變化不顯著,分析原因可能是由于L.plantarumSCS2菌體經過實驗小鼠胃腸道的復雜環境后定植在腸道黏膜上的數量較少,不能夠較好地通過維持腸道微生態平衡的方式,調節實驗小鼠的免疫系統,改善其機體的免疫潛能從而起到調節血糖的作用[1,3];而TG2小鼠各項指標均無顯著改善,可能是由于L.plantarumSCS2發酵液上清液中所含物質不具備調節血糖的能力或是L.plantarumSCS2代謝產物含量不足所致。

2.4 L. plantarum SCS2不同受試物對實驗小鼠血清中MDA、SOD、GSH和GSH-Px含量的影響

從圖6可以看出,MG小鼠血清中MDA水平最高,這可能與MG小鼠血糖水平長時間處于較高值有關。與MG小鼠相比,TG1、TG2和TG3小鼠血清中MDA水平均有所降低。該結果表明，L.plantarumSCS2細胞內容物能夠降低實驗小鼠血清中MDA水平,且該結果與TG3小鼠血糖水平的降低存在一定聯系。

圖6 實驗小鼠血清中MDA水平變化Fig.6 Change of MDA levels in serum of mice注:不同字母表示各數據間有顯著差異(p<0.05)。

從圖7可以看出,與NG小鼠相比,MG小鼠血清中SOD、GSH和GSH-Px水平均顯著降低(p<0.05)。而與MG小鼠相比,TG3小鼠血清中SOD、GSH和GSH-Px水平均顯著增加(p<0.05),而TG1和TG2小鼠血清中SOD、GSH和GSH-Px水平無顯著變化(p>0.05)。說明L.plantarumSCS2細胞內容物可能夠通過降低實驗小鼠血清中MDA水平,提高SOD、GSH和GSH-Px水平的方式改善其機體的氧化應激,從而達到降低自身血糖水平的目的。

圖7 實驗小鼠血清中SOD,GSH和GSH-Px水平變化 Fig.7 Change of SOD,GSH and GSH-Px levels in mice注:同一抗氧化酶指標中不同字母表示各組間有顯著差異(p<0.05); GSH和GSH-Px抗氧化酶水平單位為×103 pg/mL。

3 討論

目前,關于乳酸菌抗氧化和調節機體氧化應激的機制主要有以下三種假說:

乳酸菌自身具有調節氧化應激的抗氧化酶或其形成的代謝產物具有調節氧化應激的功能;乳酸菌或其代謝產物通過調節細胞信號轉導的方式調控氧化還原平衡調節因子的表達水平從而發揮對氧化應激的調節作用;乳酸菌通過對腸道菌群的調節作用而發揮對氧化應激的調節作用[1]。本文的研究結果表明,灌胃L.plantarumSCS2細胞內容物組小鼠血清中SOD、GSH和GSH-Px等抗氧化酶水平均升高,同時MDA水平降低,而SOD、GSH和GSH-Px恰好是機體Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1-核轉錄因子E2相關因子2-抗氧化反應元件(Keap1-Nrf2/ARE)信號通路調控的氧化應激應答系統中幾種重要的抗氧化酶[17-18],這一結果初步證實了第二種假說,這可能是由于L.plantarumSCS2產生的一些抗氧化劑類的物質如SOD、GSH-Px、GSH、阿魏酸等,具有調節氧化應激的作用[1]。但在L.plantarumSCS2細胞內容物中具體起到調節作用的關鍵因子及其作用機制還需要進一步研究。

4 結論

L.plantarumSCS2細胞內容物能夠降低高血糖模型小鼠的空腹和餐后2 h血糖水平,提高其對于葡萄糖的耐受能力;同時,也能夠顯著提高其血清中SOD、GSH和GSH-Px水平(p<0.05),降低血清中MDA水平的趨勢。這表明L.plantarumSCS2細胞內容物中可能含有能夠改善機體氧化應激的關鍵因子,其可能通過調節Nrf2介導的Keap1-Nrf2/ARE信號通路誘導SOD、GSH和GSH-Px等抗氧化酶表達水平上升,從而調節機體氧化應激水平,且該變化可能與實驗小鼠高血糖水平及其引起的相關癥狀的改善有一定聯系,其確切的機制還待進一步研究明確。

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