浙貝母花寧海白枇杷花保健飲料的研制及其止咳作用

王翰華,陳宏降,王 強,倪夢茜,3,阮洪生,*

(1.浙江醫藥高等?？茖W校,浙江寧波 315100; 2.寧波市中醫院,浙江寧波 315010; 3.浙江中醫藥大學,浙江杭州 310053)

浙貝母(FritillariathunbergiiMiq.)為百合科植物,其干燥鱗莖是道地藥材“浙八味”之首[1],有效成分是生物堿。前期研究表明,浙貝母花具有止咳化痰功效[2]。枇杷[Eriobotryajaponica(Thumb.)Lindl.]為薔薇科植物,其葉和花可作藥用[3],枇杷花的有效成分是黃酮。寧海白枇杷是浙江省寧海縣引進白沙枇杷,在獨特的地方小氣候環境中,優育的新品種[4]。浙貝母和寧海白枇杷都是寧波市特色經濟作物。在生長過程中,它們的花大部分被打頂或疏掉,造成很大的浪費。中醫理論而言,浙貝母味苦,性寒,歸肺、心經,有清熱散結,化痰止咳的功效,浙貝母花有止咳化痰功效[5];枇杷花味淡,微溫,歸肺經,有疏風止咳,通鼻竅的功效[6],浙貝母花與枇杷花配伍可發揮協同功效。

隨著社會進步,人民生活水平的提高及生活節奏的加快,使得亞健康人群不斷增加,人們對保健食品的需求越來越大,促使了保健飲料的高速發展同時也帶來了巨大的挑戰。保健飲料的發展已進入加速發展階段,以中藥為原料的功能飲料市場潛力巨大[7]。但目前,以止咳為賣點的保健飲料仍然較為缺乏。

前期研究表明,浙貝母花-寧海白枇杷花(4∶1)配伍時,能較好地協同發揮止咳化痰作用[8]。在此基礎上,本文以浙貝母花和寧海白枇杷花為原料,研制一款色香味俱佳的新型復合保健飲料,并考察其止咳功效,以填補市場空白,并為浙貝母和寧海白枇杷的相關藥用資源開發利用提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

浙貝母花 浙貝母花采自寧波市海曙區龍觀鄉,經楊雄志教授鑒定為百合科浙貝母FritillariathunbergiiMiq.的花;寧海白枇杷花 采自寧?？h一市鎮,經楊雄志教授鑒定,為薔薇科枇杷Eriobotryajaponica(Thumb.)Lindl.的花;貝母素乙對照品 中國食品藥品檢定研究院,批號110751-201110,含量以99.9%計;蘆丁對照品 中國食品藥品檢定研究院,批號100080-201409,含量以92.6%計;蜜煉川貝枇杷膏 廣州潘高壽藥業股份有限公司,批號160118;木糖醇、檸檬酸、蜂蜜和果膠等 市售；SPF(無特定病原體)級小鼠(體質量20～25 g,雌雄各半)、豚鼠(雌雄兼用,體質量190～210 g) 由浙江大學實驗動物中心提供,實驗動物許可證號:SYXK(浙)2012-0178。

400A型小型粉碎機 永康云達冷風機廠;DZKW-D4電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器有限公司;RE-52型旋轉蒸發儀 上海之信儀器有限公司;DSX-280A型高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;WH-2000超聲霧化器 廣東粵華醫療器械廠有限公司;TU-1818型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;DR-M2型阿貝折光儀 ATAGO(愛拓)中國分公司;MP511 pH計 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生產工藝流程

1.2.2 操作要點 預處理:將浙貝母花與寧海白枇杷花分別進行除雜后粉碎。

提取:根據確定的浙貝母花與寧海白枇杷花提取工藝操作。

粗濾:布氏漏斗(單層濾紙)抽濾。

調配:在調配灌按配方比例(浙貝母花提取液160 g/L,寧海白枇杷花提取物40 g/L)將浙貝母花提取液、寧海白枇杷花提取液混合,再加入一定量的木糖醇、檸檬酸、蜂蜜和果膠,用攪拌器充分攪拌并加熱40 min,過濾。

精濾:除去飲料中的細微顆粒及沉淀,使之澄清透明,再進行2次過濾。

滅菌:將成品放于高壓滅菌鍋中,條件為90 ℃,30 min,然后冷卻至室溫。

1.2.3 浙貝母花提取工藝

1.2.3.1 浙貝母花水提液的制備 取浙貝母花,粉碎,過4號篩,精密稱取50 g,加一定量水,提取一定時間,重復一定次數,合并提取液,過濾并濃縮至100 mL,得浙貝母花水提液,測定水提液中總生物堿量(Y1,%)及浸膏得率(Y2,%)。

1.2.3.2 提取工藝設計 根據單因素預實驗，以加水量(相對于浙貝母花質量)、提取時間及提取次數為考察因素，以總生物堿量、浸膏得率為指標(總生物堿量和浸膏得率的加權系數各為0.5)，選用L9(34)正交表進行試驗，因素水平設計見表1。采用綜合加權評分法，以正交試驗中總生物堿量和浸膏得率的最大值為100分，將各指標成分的總量分別轉換為評分值，計算綜合評分，再以綜合評分計算正交試驗結果，并進行方差分析，優選浙貝母花水提最佳工藝。

表1 浙貝母花正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments of Fritillaria thunbergii Miq. flower

1.2.2.3 總生物堿量和浸膏的測定 參考文獻[9]制備供試品,以貝母素乙標準液為對照,413 nm處測定吸光度,由標準曲線(y=0.008+0.043x,r=0.9996)計算總生物堿含量。照2015年版《中國藥典》浸出物測定法(通則2201)[10]項下方法測定,浸膏得率(%)=浸膏質量/供試品質量×100。

1.2.3 寧海白枇杷花提取工藝

1.2.3.1 寧海白枇杷花水提液的制備 取寧海白枇杷花,粉碎,過4號篩,精密稱取50 g,加一定量水,提取一定時間,重復一定次數,合并提取液,過濾并濃縮至100 mL,得寧海白枇杷花水提液。測定提取液中總黃酮量(Y3，%)及浸膏得率(Y4，%)。

1.2.3.2 提取工藝設計 根據之前單因素預試驗，以加水量、提取時間及提取次數為考察因素，以總黃酮量、浸膏得率為指標(黃酮量和浸膏得率的加權系數各為0.5)，選用L9(34)正交表進行試驗，因素水平設計見表2。采用綜合加權評分法，以總黃酮量和浸膏得率的9次試驗的最大值為100分，將各指標成分的總量分別轉換為評分值，計算綜合評分值，再以綜合評分值計算正交試驗結果，并進行方差分析，優選寧海白枇杷花水提最佳工藝。

表2 寧海白枇杷花正交實驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments of Ninghaibai Loquat flower

1.2.3.3 總黃酮量和浸膏的測定 參考王翰華等[11]的方法配制供試品,以蘆丁標準液為對照,510 nm處測定吸光度,由標準曲線(y=16.94x+0.004,r=0.9997)計算總黃酮量。照2015年版《中國藥典》浸出物測定法(通則2201)[10]測定,浸膏得率(%)=浸膏質量/供試品質量×100。

1.2.4 飲料配方的優化 在之前單因素預實驗基礎上,以保健飲料的感官評分為評價指標[12-15](表3),應用統計學方法處理數據[16],對飲料配方進行正交實驗優化,按正交表L9(34),設計正交實驗,因素與水平見表4。

表4 配方正交實驗因素水平Table 4 Factors and levels of orthogonal experiments of formula

1.2.5 質量指標檢測 由之前的紫外分光光度法測定飲料中總生物堿和總黃酮含量;阿貝折光儀測定飲料中可溶性固形物含量[17];pH計測定飲料的酸堿度;按照GB/T 4789.2-2010和GB/T 4789.3-2010分別對飲料中菌落總數、大腸菌群及致病菌進行檢測[18]。同時,在溫度40 ℃,相對濕度75%的條件下儲存3個月,考察穩定性。

1.2.6 藥效學研究

1.2.6.1 小鼠氨水引咳實驗 對昆明種小鼠進行預試[19],篩選出合格小鼠50只,雌雄各半。待小鼠穩定3 d后,隨機分為5組,每組10只,分別為空白對照組(生理鹽水)、保健飲料高、中、低劑量組(相當于浙貝母花+寧海白枇杷花6.0,3.0,1.5 g/kg)和蜜煉川貝枇杷膏陽性對照組(4.0 g/kg),參考之前方法操作[2],記錄小鼠咳嗽潛伏時間和3 min內咳嗽次數。其中,高劑量(相當于成人給藥量的40倍量)、中劑量(20倍量)、低劑量(10倍量)組,川貝枇杷膏陽性對照組(相當于成人給藥量的20倍量)。

1.2.6.2 豚鼠枸櫞酸引咳實驗 將豚鼠進行預試[19],篩選出合格豚鼠50只,分組及給藥劑量同1.2.6.1。參考之前方法處理[2],記錄豚鼠咳嗽潛伏時間及5 min內咳嗽次數。

1.3 數據處理

應用SPSS 19.0統計軟件對實驗數據進行統計分析,包括方差分析,顯著性差異分析等。

2 結果與分析

2.1 浙貝母花提取工藝的確定

正交實驗結果直觀分析見表5,影響提取效果的順序為提取時間>加水量>提取次數,確定浙貝母花最佳提取條件為表A3B3C3,即加12倍量水,每次提取2 h,提取3次。此條件下,總生物堿量為0.328%,浸膏得率為4.83%,綜合評分98.66。方差分析顯示,3個因素對結果影響都不顯著,見表6。

表5 浙貝母花正交實驗結果Table 5 Results of orthogonal experiments of Thunberg Fritillary flower

表6 浙貝母花方差分析Table 6 Analysis of variance of Thunberg Fritillary flower

2.2 寧海白枇杷花提取工藝的確定

正交實驗結果及直觀分析見表7,影響提取效果的順序為提取時間>提取次數>加水量,結合大生產及耗能,確定寧海白枇杷花最佳提取條件為表A2B2C1,即加9倍量水,每次提取1.5 h,提取1次。此條件下,總黃酮量為0.368%,浸膏得率為6.04%,綜合評分98.77。方差分析顯示,3個因素對結果影響都不顯著,見表8。

表7 寧海白枇杷花正交實驗結果Table 7 Results of orthogonal experiments of Ninghaibai Loquat flower

表8 寧海白枇杷花方差分析Table 8 Analysis of variance of Ninghaibai Loquat flower

2.3 飲料配方的確定

由方差分析(表10),4個因素對結果影響都不顯著。配方正交實驗結果見表9,方差分析見表10?？芍?對飲料品質影響最大的因素是蜂蜜的添加量,其次是木糖醇和檸檬酸的添加量,而果膠的添加量對飲料品質的影響相對較小;最優結果為A2B1C3D3,即最佳配比條件是40 g/L的木糖醇、0.5 g/L的檸檬酸、35 g/L的蜂蜜和3 g/L的果膠。經驗證實驗,該配方的平均得分達到92分(n=5,RSD0.37%),確定為最佳配方。

表9 配方正交實驗結果Table 9 Results of orthogonal experiments of formula

表10 感官評分方差分析Table 10 Analysis of variance of sensory score

2.4 質量檢測結果

隨機抽取5瓶成品進行檢測,該飲料中總生物堿量為(0.12±0.010) mg/mL,總黃酮量(0.40±0.018) mg/mL,這為飲料發揮保健功能奠定了基礎?？扇苄怨绦挝锖?20 ℃,折光法)≥45%,pH為5.5,細菌總數≤100 CFU/mL,大腸桿菌≤0.02 MPN/mL,致病菌未檢出,均符合相關規定。穩定性實驗結果表明,產品在感官上變化不大,略有微量沉淀析出,pH為5.4,可溶性固形物的量保持穩定,菌落群數和大腸桿菌未超標。

2.5 藥效學結果

2.5.1 對小鼠氨水引咳影響 由表11可得,與空白對照組比較,保健飲料高、中劑量組和陽性對照組蜜煉川貝枇杷膏,均能顯著延長小鼠咳嗽潛伏期并減少小鼠咳嗽次數(p<0.05);保健飲料高、中劑量組與陽性對照組蜜煉川貝枇杷膏比較,未有顯著差異。表明,該保健飲料能明顯抑制由氨水引起的小鼠咳嗽。

表11 對小鼠氨水引咳的影響Table 11 The effects of ammonia water

2.5.2 對豚鼠枸櫞酸引咳影響 由表12可知，與空白對照組比較,保健飲料高、中劑量組和陽性對照組蜜煉川貝枇杷膏,均能顯著延長豚鼠咳嗽潛伏期并減少小鼠咳嗽次數(p<0.05),低劑量組雖有改善,但無統計學意義;保健飲料高、中劑量組與陽性對照組蜜煉川貝枇杷膏比較,未有顯著差異。表明,該保健飲料對枸櫞酸引咳豚鼠有良好的抑制作用。

表12 對豚鼠枸櫞酸引咳的影響Table 12 The effects of citric acid causing cough in guinea

3 結論與討論

本研究確定浙貝母花-寧海白枇杷花保健飲料的最佳配方為:浙貝母花提取液160 g/L,寧海白枇杷花提取物40 g/L,木糖醇40 g/L、檸檬酸0.5 g/L、蜂蜜35 g/L、果膠3 g/L。檢測結果表明所研制的保健飲料工藝穩定,各項指標均符合保健食品相關規定。藥理實驗表明,具有顯著的止咳作用。

口感是保健飲料品質評價中最重要的指標,但為了改善口感,人們通常會降低飲料主成分,導致無法發揮良好的保健功能[20]。針對這一問題,本文為確保發揮飲料的最佳保健功效,在前期實驗基礎上,固定了浙貝母花提取液和寧海白枇杷花提取液的配比4∶1,通過調整木糖醇、檸檬酸、蜂蜜和果膠的配比來確定飲料的口感;在產品質量檢測過程中,參考《中國藥典》的標準,不僅對理化指標及微生物檢測指標進行檢測,還對飲料中的總生物堿和總黃酮含量進行了測定,從而確保飲料中有效成分的含量,進一步保證飲料的保健功能。

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