酶解超聲組合提取蒲公英中綠原酸的工藝優化

徐樹來,金慧榮,任紅波,王 麗,張 靜,陳井權,溫 暖

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076; 2.黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076; 3.黑龍江省農業科學院農產品質量安全研究所,黑龍江哈爾濱 150086; 4. 哈爾濱商業大學校醫院,黑龍江哈爾濱 150076; 5. 海倫野泰食品加工有限公司,黑龍江綏化 152000)

目前常見的提取綠原酸的方法有水提法[11]、醇提法[12]、微波提取法[13]、酶解-超聲組合法等。水提法和醇提法提取工藝雖然簡單,但提取率較低,雜質較多,不利于后期純化。微波提取法是一種新型節能的輔助提取方法,熱量可直接作用于分子的加熱過程,雖提取速率增加,但綠原酸為熱敏物質,極易造成綠原酸結構的破壞,用于綠原酸的提取具有一定的局限性。本研究采用酶解超聲組合使用,具有條件溫和,操作便捷,提取率高,提取物結構不被破壞等優點。

本文選用酶解超聲聯用提取蒲公英莖葉中綠原酸,運用單因素實驗篩選提取因素及水平范圍,最終確定纖維素酶添加量、酶解時間、超聲時間和超聲功率為主要影響因素,并進行響應面優化,從而研究酶解-超聲組合提取蒲公英綠原酸的最佳工藝條件,以期為蒲公英的精深加工及綜合利用提供有益的探究及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生干蒲公英莖葉 海倫野泰食品加工有限公司;綠原酸標準品(純度98%,NO.17030620)、葡萄糖標準液(純度98%,NO.20170106) 中國食品藥品鑒定研究院;無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、正己烷、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鈉、無水亞硝酸鈉、羧甲基纖維素鈉、乙酸、乙酸鈉均為分析純、硅藻土 天津市天力化學試劑有限公司;纖維素酶 固體,酶活:100 U/mg,和氏璧生物科技有限公司。

DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海恒科科技有限公司;DEF-500型搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;HC-7P11-5 型架盤藥物天平 上海精科科技有限公司;HH-4水浴鍋 金壇市天瑞儀器有限公司;FA2004B型電子天平 上海越平科學儀器有限公司;KQ-500VDED雙頻數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TDL-4A 離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司;UV-5200紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;pH計測試儀 上海儀電科學儀器股份有限公司;85-2恒溫磁力攪拌器 金壇市城東新瑞儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法 精確稱取過80目篩的蒲公英干粉2.00 g,采用正己烷脫脂(熱回流法,條件為料液比1∶10,脫脂溫度50 ℃,脫脂時間0.5 h),脫脂樣品置于100 mL的燒杯中,加入體積分數70%的乙醇水溶液(通過預實驗確定乙醇濃度為70%),添加纖維素酶,調節pH[14],調節溫度,酶解一定時間后,沸水浴5 min滅酶,然后進行超聲處理,旋轉蒸發至約為提取液體積的1/3,向溶液中加入2 g硅藻土(吸附大分子蛋白質和糖),置于磁力攪拌器上攪拌5 min,8000 r/min離心10 min,取清液,即得蒲公英綠原酸提取液。

1.2.2 單因素實驗 按照1.2.1的實驗步驟,通過預實驗設定因素固定水平:乙醇濃度70%、纖維素酶用量0.3%(占干料的百分比)、酶解時間1.0 h、pH4、酶解溫度50 ℃、超聲功率150 W、超聲時間1.5 h、料液比1∶20 (g/mL)。根據預實驗結果,酶解溫度、酶解pH、料液比對綠原酸提取率影響不大,固不作為后續實驗的考察因素。分別考察各單因素對綠原酸得率的影響:纖維素酶用量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%;酶解時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h;超聲功率50、100、150、200、250 W;超聲時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。

1.2.3 響應面優化實驗 選取纖維素酶添加量、纖維素酶解時間、超聲功率、超聲時間為主要影響因素,根據單因素實驗確定的水平值,以綠原酸得率為考察指標,進行響應面優化,參閱文獻方法進行實驗設計[15],因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.3 檢測方法

1.3.1 纖維素酶活性的測定 采用3,5-二硝基水楊酸法[16],測定纖維素酶樣品活性,并測定提取條件下70%乙醇[17]溶液中的活性。1 mg酶每分鐘水解生成1微克葡萄糖的量定義為一個活力單位U。

1.3.1.1 標準曲線繪制 取6只25 mL比色管,分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖于6支試管中,均用蒸餾水稀釋至1 mL,加3,5-二硝基水楊酸顯色劑3 mL,在沸水浴中煮沸顯色10 min,冷卻,定容至25 mL。在550 nm處比色測其OD值。以光密度為縱坐標A,以葡萄糖微克數為橫坐標m,繪出標準曲線。得到方程:A=0.5867m-0.0096。

1.3.1.2 樣品測定 取1 mL酶液(0.05 mg/mL),沸水浴5 min,冷卻后加3 mL 0.5% CMC作為空白,取三支比色管,分別加入0.5% CMC 3 mL,酶液1 mL,混勻后與空白管一起于50 ℃水浴鍋中水浴30 min,取出,立即于沸水浴中煮沸10 min使酶失活,冷卻加入3 mL顯色液,再沸水浴10 min,冷卻后加蒸餾水定容至25 mL,混勻,于550 nm處測OD值。按照下式計算酶活力。

式中:X:酶活力(U/mg);N:試樣溶液反應前的總稀釋倍數;m:OD值對應的葡萄糖量;t:反應時間。

1.3.2 綠原酸得率的測定

1.3.2.1 測定波長的選擇 精密稱取綠原酸42.5 mg,無水乙醇溶液溶解,并定容于1000 mL的容量瓶中,搖勻,得到42.5 mg/L的綠原酸標準液。取適量綠原酸標準液于500～200 nm范圍內掃描,以無水乙醇溶液作參比,得到綠原酸在329 nm處有最大吸收峰,故選擇于329 nm處測量綠原酸的吸光度[18]。

準確稱取綠原酸標準品5 mg,用無水乙醇溶解并稀釋至標準液濃度分別為2.00、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00、24.00 μg/mL。以無水乙醇做參比液,在329 nm處測定各標準品溶液的紫外吸光度OD。以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制綠原酸標準曲線[4]。得到方程:A=0.0566C-0.0096,R2=0.9986。

1.3.2.2 樣品的測定 取蒲公英綠原酸提取液,用相應的提取濃度的乙醇溶液定容至100 mL,得到待測溶液。以無水乙醇做參比液,用紫外分光光度計在329 nm處測定樣品溶液的吸光度OD。

綠原酸得率計算公式為[4]:

式中:Y:綠原酸得率(%);V:待測試樣液的體積(mL);X:待測試樣液的濃度(μg/mL);F:稀釋倍數;m:蒲公英樣品質量(μg)。

1.4 數據統計分析

實驗操作重復三次取平均值,計算標準誤差并制圖分析。選用Design-Expert 8.0軟件進行響應面分析處理,建立多元回歸數學模型。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 纖維素酶添加量對綠原酸得率的影響 纖維素酶添加量對綠原酸得率的影響如圖1所示。酶添加量為0.1%～0.5%,添加酶時各個濃度下酶的活性相同均為99.996 U/mg,70%乙醇酶解后不同酶添加量下酶活性的平均值為(99.985±0.005) U/mg。由圖1可以看出,在纖維素酶添加量為0.1%～0.3%時,綠原酸得率上升,在0.3%～0.5%時綠原酸得率開始下降。由于纖維素酶破壞了植物細胞壁,使包裹在細胞內的綠原酸釋放出來[17],但隨纖維素酶濃度的增加,細胞壁破壞加劇,胞內其他干擾性物質也隨之釋出,可能通過影響提取過程而降低綠原酸的得率。所以選擇酶添加量0.2%～0.4%(占干料的百分比)為響應曲面實驗參數范圍。

圖1 纖維素酶添加量對綠原酸得率的影響 Fig.1 Effect of cellulase addition on the yield of chlorogenic acid

2.1.2 酶解時間對綠原酸得率的影響 酶解時間對綠原酸得率的影響如圖2所示。添加酶時酶的活性為99.996 U/mg,70%乙醇酶解后不同酶解時間下酶活性的平均值為(99.984±0.008) U/mg。由圖2可以看出,蒲公英中綠原酸的得率呈先上升后下降的趨勢,在酶解時間為1 h時,蒲公英綠原酸得率最高。分析原因是,酶解時間不足,綠原酸得不到有效釋出;但酶解時間延長,酶活性得到充分利用,酶促反應完全,時間過長可能會引起綠原酸的氧化分解[19],綠原酸得率反而下降。酶解時間的變化,對綠原酸的得率有較大的影響。因此,選取酶解時間0.5～1.5 h為響應曲面實驗參數范圍。

圖2 酶解時間對綠原酸得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the yield of chlorogenic acid

2.1.3 超聲功率對綠原酸得率的影響 超聲功率對綠原酸得率的影響如圖3所示,可以看出,當功率50～150 W,綠原酸得率增加;在150～250 W時,綠原酸得率逐漸下降。這是因為超聲功率越大,質點的振動速度越大,物料內部的傳質更為劇烈[20-21],而使細胞壁遭到破壞[22],有效成分容易滲出,從而使得率明顯提高;但隨超聲功率的增大,綠原酸得率降低。所以選取適宜的超聲功率范圍為100～200 W為響應曲面實驗參數范圍。

圖3 超聲功率對綠原酸得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of chlorogenic acid

2.1.4 超聲時間對綠原酸得率的影響 超聲時間對綠原酸得率的影響如圖4所示,可以看出,綠原酸得率隨超聲時間延長,呈現先上升后又有所下降的趨勢,這是因為超聲波對植物細胞壁有破壞作用,隨超聲時間增加,對細胞壁的破壞程度加大,綠原酸類物質易于溶出[23];隨著超聲時間的繼續延長,細胞壁被完全破壞,細胞內其他干擾性物質溶出,可能通過影響提取過程而使綠原酸得率下降。所以選取適宜超聲時間范圍1～2 h為響應曲面實驗參數范圍。

圖4 超聲時間對綠原酸得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid

2.2 響應面實驗

2.2.1 響應面實驗結果 在單因素實驗結果的基礎上,根據Box-Behnken實驗設計因素水平(表1),進行了四因素三水平共29個實驗點的綠原酸提取實驗,實驗安排及結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Results of response surface test

利用Design-Expert 8.0軟件對表2中綠原酸得率數據進行回歸擬合分析,得到回歸方程:Y=2.09-0.59A-0.073B+0.081C+0.082D-0.22AB+0.095AC-0.032AD+0.045BC+0.020BD+0.087CD-0.11A2-0.16B2-0.19C2-0.17D2

2.2.2 響應面交互作用分析 軟件分析得到各因素對應的響應面和等高線圖,見圖5～圖10。響應面圖是響應值對各實驗因素所構成的三維空間曲面圖,可直觀的反應各因素的交互作用[24-25]。由圖5和表3可知,交互作用項纖維素酶添加量和酶解時間的等高線圖為橢圓形,且p<0.0001,說明纖維素酶添加量和纖維素酶酶解時間交互作用極顯著。由圖6、圖10和表3可知,交互作用項纖維素酶添加量和超聲功率的等高線圖,超聲功率和超聲時間的等高線圖均為橢圓形,且p<0.05,說明兩組交互作用項的交互作用均顯著。由圖7、圖8、圖9和表3可知,交互作用項的等高線圖趨近圓形,且p>0.05,說明交互作用效果不顯著。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

圖5 纖維素酶添加量和酶解時間的交互作用對綠原酸得率的影響Fig.5 Effect of the interaction of cellulase addition and enzymolysis time on the yield of chlorogenic acid

圖6 纖維素酶添加量和超聲功率的交互作用對綠原酸得率的影響Fig.6 Effect of the interaction of cellulase addition and ultrasonic power on the yield of chlorogenic acid

圖7 纖維素酶添加量和超聲時間的交互作用對綠原酸得率的影響Fig.7 Effect of the interaction of cellulase addition and ultrasound time on the yield of chlorogenic acid

圖8 酶解時間和超聲功率的交互作用對綠原酸得率的影響Fig.8 Effect of interaction enzymolysis time and ultrasonic power on the yield of chlorogenic acid

圖9 酶解時間和超聲時間的交互作用對綠原酸得率的影響Fig.9 Effect of enzymatic hydrolysis time and ultrasound time on the yield of chlorogenic acid

圖10 超聲功率和超聲時間的交互作用對綠原酸得率的影響Fig.10 Effect of ultrasonic power and ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid

2.3 驗證實驗

利用軟件對工藝參數進行優化,最佳提取條件:酶添加量為0.29%,酶解時長為0.95 h,超聲功率162.51 W,超聲時間1.65 h,在此條件下綠原酸的得率最高,達到了2.12%。但為了驗證模型的有效性,并結合實際情況,將最佳工藝條件調整為:纖維素酶添加量0.3%(占干料的百分比),酶解時間為1.0 h,超聲功率為163 W,超聲時間為1.7 h,在此工藝條件下進行三次驗證性實驗并取其平均值,最終綠原酸得率為2.14%±0.02%,與模型預測值(2.12%)相近。

通過Box-Behnken實驗設計建立了提取蒲公英中綠原酸的優化回歸方程模型,經過分析該模型擬合度良好。與傳統的提取方法相比,提取率明顯的提高,李立順[26]采用傳統的超聲波方法提取蒲公英中綠原酸,單純的使用超聲波方法,細胞壁破壞不完全,綠原酸不能大部分釋放出,使其得率僅為0.25%,相比之下,本實驗結果增加了1.89%。倪悅[27]采用酶法提取蒲公英中綠原酸,酶解時間過長,在提取過程中容易導致酶失活性,而影響綠原酸的析出,其得率為0.53%,相比之下本實驗結果增加了1.61%。本文采用酶解和超聲聯用的方法,先讓酶作用后,細胞壁上的纖維素有部分降解,甚至有些細胞會破裂,有利于超聲波的進一步分解,促進綠原酸的釋放,而先用超聲波時,細胞壁由于纖維素的保護作用,超聲波的破碎作用有限,故選用先酶解后超聲波提取方法。

3 結論

本文采用酶解-超聲組合方法提取蒲公英中綠原酸。通過單因素實驗及響應面優化,獲得蒲公英中綠原酸提取的最優工藝條件為:乙醇濃度70%，纖維素加酶量0.3%,酶解時間為1.0 h,酶解pH為4,酶解溫度50 ℃,超聲功率163 W,超聲時間1.7 h,料液比1∶20 g/mL,在此條件下,綠原酸得率為2.14%。研究結果表明:酶解超聲組合方法較適合提取蒲公英中的綠原酸,響應面分析法較好地優化了提取工藝,在最優提取工藝條件下,綠原酸得率達2.14%,與現有同類研究相比,本方法可有效提高綠原酸的提取得率。本研究為蒲公英的精深加工及綜合利用提供有益的探究及參考。

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