柿果膠提取工藝優化及理化性質研究

張雪丹,楊娟俠,王 丹,王明林,辛 力,*

(1.山東省果樹研究所,山東泰安 271000; 2.山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271000)

果膠是一種天然的大分子聚合性多糖,以由α-1,4-糖苷鍵連接組成的D-半乳糖醛酸等酸性雜多糖為主。果膠大量存在于植物細胞壁中,對維持植物的結構、硬度和細胞pH等有至關重要的作用[1-3]。

果膠因具有良好的乳化、增稠、穩定和凝膠作用而被廣泛應用,如在食品領域,果膠主要是作為膠凝劑、穩定劑和脂肪替代品等功能性食品配料;在醫藥領域,果膠具有降低血脂、抵抗各種癌癥等多種功能;作為生物聚合物,果膠逐漸在活性包裝中得到廣泛應用[4-6]。目前,果膠的主要來源是柚子和柑橘等果皮,更多的具有不同結構和凝膠性能的亟待開發果膠[7-8]。

柿果含有豐富的果膠物質且果膠品質良好[9-10],但因澀柿果含有大量單寧,單寧與果膠的氫鍵和疏水鍵相互作用而產生聚集,抑制了果膠的提取效率[11-12],因此本研究以脫澀的柿果為原料進行柿果膠提取工藝優化研究,這不僅可解決澀柿商品價值低、深加工產品少的問題,還可為生產提供新的果膠產品。

本研究在單因素實驗的基礎上,以果膠得率為響應值,通過響應面分析法對柿果膠酸提醇沉法的提取工藝進行優化,為柿果膠的工業化生產提供技術支持。同時對果膠進行色澤、酯化度、分子量、單糖組成和紅外光譜等理化性質和組成成分分析,為柿果膠的進一步開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金瓶柿 2015.10.17和2016.10.9采摘于山東省臨沂市沂水縣高橋鎮鳳凰官莊柿園;單糖標準品巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸(均為分析純)、葡聚糖標準品MW135350、36800、9750、2700 Da(均為色譜純)、溴化鉀(光譜純) 美國Sigma公司;氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、醋酸鈉、酚酞三氟乙酸 分析純,天津市凱通化學試劑有限公司。

Minolta CR-400色差計 日本Minolta株式會社;ML-204電子天平 梅特勒—托利多國際貿易(上海)有限公司;MS300磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司;5810R高速離心機 艾本德(上海)國際貿易有限公司;0.22 μm微孔濾膜和膜過濾器 上海興亞凈化材料廠;ICS-5000離子色譜儀 美國Dionex股份有限公司;Nicolet Nexus 470傅里葉紅外光譜儀 美國Termo Electron 公司;Waters1525 高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 以金瓶柿為試材,柿果在20 ℃下,CO2含量90%～95%的密閉環境中脫澀處理24 h,然后均勻切制成5 mm厚度的薄片,并經55 ℃恒溫干燥,打粉,過100目篩備用。

1.2.2 柿果膠提取工藝 稱取10.0 g柿粉,加入一定液料比和不同pH的HCl提取液,在特定溫度下加熱提取一定時間后快速過濾,濾液冷卻至0 ℃時加入與濾液等量的95%乙醇提取,靜置1 h后離心10 min(5000 r/min,0 ℃)得絮狀沉淀,然后用20 mL 70%酸性乙醇(0.5% HCl)洗滌沉淀1 h,離心10 min(5000 r/min,0 ℃)后沉淀用20 mL 96%乙醇洗滌1 h,再次離心(5000 r/min,0 ℃),沉淀置于45 ℃烘箱中烘干24 h,粉碎后即得柿果膠。

1.2.3 提取工藝優化

1.2.3.1 單因素實驗 選取提取液pH、液料比、提取時間、提取溫度作為影響因素,以柿果膠得率為評價指標,進行單因素實驗。研究提取液pH對果膠得率影響的單因素實驗條件為液料比20∶1 (g/g),提取溫度60 ℃,提取時間60 min,pH分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5;液料比對果膠得率影響的單因素實驗條件為提取液pH4.0、提取溫度60 ℃,提取時間60 min,液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1和35∶1 (g/g);提取時間對果膠得率影響的單因素實驗條件為提取液pH4.0,液料比20∶1 (g/g),提取溫度70 ℃,提取時間分別為50、70、90、110、130 min;提取溫度對果膠得率影響的單因素實驗條件為提取液pH4.0,液料比20∶1 (g/g),提取時間60 min,提取溫度分別為70、80、90、100 ℃。每個處理做三個重復。

1.2.3.2 響應面實驗 在單因素實驗的基礎上,根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理,采用四因素三水平的響應面分析法,以果膠得率為響應值,設計響應面分析實驗,實驗因素和水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 柿果膠理化性質的分析

1.2.4.1 提取果膠的色澤 將干燥、粉碎后的柿果膠平鋪(5 mm),用Minolta CR-400色差計測定色澤,讀取L*、a*、b*值。采用Hunter表色系統[13-14],以L*、C*、h°表示柿果果膠的顏色變化,其中L*為果膠亮度;C*為彩度,C*值越大表明樣品顏色越純;h°為色度角,h°值越大表示樣品紅色減弱,黃色增強。C*和h°的計算公式如下:

1.2.4.2 果膠酯化度測定 果膠酯化度(degree of esterification,DE)的測定參考Pinheiro[15]的方法并稍有改進。稱取50.0 mg柿果膠樣品移入250 mL碘量瓶中,用2 mL乙醇潤濕,加入100 mL不含CO2的純水,塞緊瓶口振蕩,待樣品全部溶解后加入5滴1.0%的酚酞,用0.1 mol/L 的NaOH標準溶液進行滴定,記錄所消耗NaOH的體積(V1)即為初滴定度。繼續加入20 mL、0.5 mol/L 的NaOH標準液,加塞后強烈振搖15 min,加入20 mL、0.5 mol/L的HCl溶液,振搖至粉紅色消失為止。然后加入5滴酚酞,用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至呈微紅色。記錄消耗NaOH的體積(V2)即為皂化滴定度。酯化度計算公式:

1.2.4.3 果膠分子量測定 采用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)測定柿果膠分子質量[16],樣品處理與色譜條件如下:稱取樣品15 mg溶解于流動相中,定容至10 mL,離心后上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾后供進樣。儀器:Waters1525 高效液相色譜儀;色譜柱:UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm×2;流動相:0.1 mol/L NaNO3;流速:0.9 mL/min;柱溫:45 ℃;檢測器:示差折光檢測器。分子量校正曲線所用葡聚糖對照品標準品:Dextran Standand(MW135350、36800、9750、2700 Da)。

1.2.4.4 單糖組成分析 采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測器測定柿果膠單糖組成[17],樣品處理與色譜條件如下:稱取10.0 mg柿果膠樣品加入1.0 mL的4.0 mol/L的三氟乙酸(TFA),充N2后封閉試管,110 ℃烘箱中水解2 h,冷卻后打開試管,用N2吹干除去TFA,水解的果膠液用超純水定容至50 mL,離心后上清液經0.22 μm微膜過濾后進樣。將上述水解后的果膠液樣進至Dionex的ICS-5000離子色譜儀,采用梯度法測定果膠的單糖組成。離子色譜條件:色譜柱:CarboPac PA20(3×150 mm);流動相:水、250 mmol/L NaOH和1.0 mol/L CH3COONa梯度洗脫;流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:100 μL;檢測器:脈沖安培檢測器檢測。

1.2.4.5 果膠的紅外光譜(IR)分析 參照Park等[18]的方法,將適量的果膠樣品與預先干燥好的KBr混勻并研細,壓片制樣,用傅里葉紅外光譜儀迅速在4000～400 cm-1的區間進行紅外光譜掃描,觀察譜峰情況。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 柿果膠單因素提取實驗

2.1.1 提取液pH對果膠得率的影響 有研究報道,酸液提取是果膠酸提工藝中最重要的因素,其效果直接決定著果膠的最終產量,并對質量也有很大的影響[19]。我們研究不同pH的HCl提取液對柿果膠得率的影響,實驗結果如圖1所示。研究發現,pH2.0～4.0時,果膠得率隨pH增加而增加,pH4.0時果膠得率最高,隨后果膠得率隨pH增加而降低。這可能是因為柿果膠在強酸環境下(pH<3.5)會去酯化和配糖鍵水解,弱酸環境下(pH>4.0)會產生去酯化,引起果膠分子降解,使長鏈變成短鏈,造成果膠得率的下降,從而影響柿果膠的最終產量[20-21]。

圖1 pH對果膠得率的影響Fig.1 Effects of pH on the pectin yield

2.1.2 液料比對果膠得率的影響 圖2為液料比對柿果膠得率的影響。從上圖可知,當液料比在10∶1～25∶1 (g/g)之間時,果膠得率呈上升趨勢,隨后果膠得率呈下降趨勢,酸提醇沉柿果膠時液料比為25∶1時果膠得率最高。這可能是由于液料比太低導致無法完全溶解和提取出原料中的柿果膠,液料比過高則會浪費酸溶液,同時增加后續過濾和沉淀難度,使得果膠損失增大[22],因此選用25∶1為最適液料比。

圖2 液料比對果膠得率的影響Fig.2 Effect of solvent-to-solid ratio on the pectin yield

2.1.3 提取時間對果膠得率的影響 研究不同提取時間對果膠得率的影響,結果表明(見圖3),果膠得率隨提取時間增加出現先升高后降低的趨勢,提取時間在90 min時,果膠得率最高。這可能是由于酸提取時間過短,原果膠不能充分水解,而酸提取時間過長,部分果膠又被進一步水解成果膠酸[23],從而降低了果膠得率。

圖3 提取時間對果膠得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on the pectin yield

2.1.4 提取溫度對果膠得率的影響 圖4為提取溫度對果膠得率的影響,由此可知,提取溫度對果膠得率的影響較大,提取溫度在70～90 ℃時,果膠得率隨提取溫度的升高而增加。但提取溫度超過90 ℃后果膠得率下降,這可能是因為溫度升高有利于果膠的水解,但當溫度過高時會破壞果膠的結構,致使果膠變性，使果膠的得率降低[24]。因此選取了80、85、90 ℃作為提取溫度。

圖4 提取溫度對果膠得率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on the pectin yield

2.2 響應面法優化柿果膠提取結果分析

2.2.1 響應面實驗設計與結果 超聲波提取柿果膠的響應面實驗設計方案和結果如表2所示。本分析實驗共有29個實驗點,其中1～24為析因實驗,25～29為零點中心實驗,析因點為因素X1、X2、X3和X4所構成的多維空間頂點;零點為區域的中心點,中心實驗重復5次,用以估計實驗誤差。

表2 柿果膠提取響應面分析實驗設計及結果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experiment data

采用Design-Expert 8.06軟件對表2的結果進行多元線性回歸擬合,得到柿果膠得率(Y)對提取液pH(X1)、液料比(X2)、提取時間(X3)、提取溫度(X4)的二次多項回歸方程模型:Y=6.352-0.08X1-0.312X2+0.718X3+0.901X4+0.143X1X2+5.000E-003X1X3+0.048X1X4+0.013X2X3+0.06X2X4-0.265X3X4-0.321X12- 0.284X22-0.190X32- 0.223X42。同時,對表2數據進行方差分析,結果如表3所示。

由表3可知,果膠得率模型顯著,一次項X1、X2、X3、X4均極顯著;二次項X12、X22、X32、X42極顯著;交互項X1X2、X3X4極顯著,其余交互項均不顯著。4個因素對柿果膠得率的影響順序為:X4>X3>X2>X1。

表3 回歸模型系數顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significance testing and variance analysis of model regression coefficient

二次回歸方程的F檢驗和失擬性檢驗結果表明:模型F值為197.35,p<0.01,說明模型顯著;失擬項p>0.05,二次回歸方程的擬合性較好,即可用此回歸模型對果膠提取進行分析和預測。

2.2.2 響應面分析 根據果膠得率的二次回歸方程,用Design-Expert 8.06 軟件繪制響應曲面三維空間圖和等高線圖,分析提取液pH(X1)、液料比(X2)、提取時間(X3)、提取溫度(X4)對柿果膠得率的影響,響應曲面立體圖見圖5～圖10。

圖5 pH和液料比對果膠得率的影響Fig.5 Effects of pH and solvent-to-solid ratio on the pectin yield on the pectin yield

圖6 pH和提取溫度對果膠得率的影響Fig.6 Effects of pH and temperature on the pectin yield on the pectin yield

圖7 液料比和提取時間對果膠得率的影響圖Fig.7 Effects of solvent-to-solid ratio and extraction time on the pectin yield

圖8 提取時間和提取溫度對果膠得率的影響Fig.8 Effects of extraction time and extraction temperature on the pectin yield

圖9 pH和提取時間對果膠得率的影響圖Fig.9 Effects of pH and extraction time on the pectin yield

圖10 液料比和提取溫度對果膠得率的影響Fig.10 Effects of solvent-to-solid ratio and extraction temperature on the pectin yield

響應面的坡度變化和等高線的形狀可以反映提取液pH(X1)、液料比(X2)、提取時間(X3)、提取溫度(X4)這四個因素間對果膠得率的交互作用效應。由圖5可知,提取液pH(X1)與液料比(X2)的交互作用對果膠得率的影響極顯著(p<0.01)。pH(X1)的變化引起的響應面坡度變化相對平緩,而液料比(X2)的變化引起的響應面坡度變化較陡峭,橢圓在液料比(X2)區排列更密集,表明液料比(X2)的變化對響應值變化的影響更大;由圖6可知,提取溫度(X4)與pH(X1)的交互作用對果膠得率的影響不顯著,但提取溫度(X4)的變化對響應值變化的影響更大;由圖7可知,提取時間(X3)與液料比(X2)的交互作用對果膠得率的影響不顯著,但提取時間(X3)的變化對響應值變化的影響更大;由圖8可知,提取液提取時間(X3)與提取溫度(X4)的交互作用對果膠得率的影響極顯著(p<0.01),但相對于提取時間(X3),提取溫度(X4)的變化對響應值變化的影響更大;由圖9可知,提取時間(X3)與pH(X1)的交互作用對果膠得率的影響不顯著,但在兩者的交互作用中,提取時間(X3)相對于pH(X1)對響應值變化的影響更大;由圖10可知,提取溫度(X4)與液料比(X2)的交互作用不顯著,但在兩者的交互作用中提取溫度(X4)相對于液料比(X2)的響應值變化的影響更大。

2.2.3 最佳提取條件確定 對果膠提取回歸模型進行典型性相關分析,獲得柿果膠提取的最佳提取條件為:HCl提取液pH=3.975,液料比為23.15∶1 (g/g),提取時間107.40 min,提取溫度92.2 ℃,在此條件下,果膠得率的理論值可達7.38%。

2.3 驗證實驗

為檢驗響應面分析法提取果膠最佳提取條件的可靠性,進行驗證實驗,考慮到實際操作的便利,將最佳工藝修正為HCl提取液pH4.00,液料比為23∶1,提取時間107 min,提取溫度92 ℃,在此條件下所得的果膠得率為7.31%,與預測值相差不到1%,說明二次多項式回歸方程能較好地預測柿果膠得率,響應面法優化柿果膠提取工藝是可行的。

2.4 柿果膠理化性質分析

2.4.1 柿果膠的色澤 采用以上提取條件提取的柿果膠呈紅褐色,通過色差計測定的L*、a*、b*分別為 30.74、9.37和9.07,由此可知果膠亮度L*為30.74;彩度C*為13.04;色度角h°為44.07。果膠的色澤在一定程度上反映了果膠的質量,一般來說,亮度L*和色度角h°值越低表明果膠顏色越深,彩度C*越低表明果膠中酸不溶物含量增多及灰分成分越多,即果膠質量越差。果膠提取過程中酸度的增加會促進多糖水解產生單糖,而單糖更容易發生美拉德反應,造成果膠顏色加深[25-26],因此生產上需對提取的果膠進行脫色處理。

2.4.2 柿果膠的酯化度 果膠的酯化度是反映果膠品質的重要指標之一,酯化度越高,果膠純度越高,凝膠性越強[27-28]。本實驗中提取果膠酯化度為98.88%±0.82%,即酸提醇沉法提取的柿果膠為高酯化度果膠。

2.4.3 柿果膠的分子量 利用液相色譜測定提取的柿果膠的分子量,分子量檢測結果以重均分子量表示,柿果膠的平均分子量為405.3 kDa。

2.4.4 柿果膠的單糖組成 提取的柿果膠水解后經離子色譜分析,根據出峰順序發現果膠分子中含有巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸等7種單糖(圖11),各組分相對含量分別為0.22%、1.42%、3.14%、15.47%、1.28%、10.08%、68.39%。由此可知,柿果膠主要的單糖成分為半乳糖醛酸、葡萄糖和果糖。結果表明,提取的柿果膠符合世界糧農組織(FAO)、歐盟(EU)和我國行業標準關于食品添加劑果膠其半乳糖醛酸含量必須高于65%的標準[29]。

圖11 柿果膠的離子色譜圖Fig.11 Ion-chromatography of persimmon pectin注:1.巖藻糖;2.阿拉伯糖;3.半乳糖; 4.葡萄糖;5.木糖;6.果糖。

2.4.5 柿果膠的紅外光譜 采用紅外光譜儀對提取的柿果膠樣品進行結構分析,結果如圖12所示。3423.10和2934.38 cm-1左右的吸收峰為多糖物質的特征吸收峰,分別是由O-H和CH2基團的C-H伸縮振動引起的[30];1738.75 cm-1左右的峰為果膠羧羰基和酯羰基中的C=O的伸縮振動,此峰表明有乙酰基的存在,1613.99 cm-1左右的吸收峰為果膠羧基中的COO-的振動,這兩者的峰比值可以用來表征果膠的酯化度[31-32];1445.61 cm-1左右的吸收峰是由-CH3反對稱伸縮振動或-CH2-對稱伸縮振動引起的[33];1344和1229 cm-1左右的吸收峰分別是由C-H彎曲運動和C-O擴張運動引起的[34];1100～1200 cm-1之間存在R-O-R和C-C吸收峰,說明該果膠有環狀結構,且在1540～1560 cm-1處有微弱的吸收峰,說明可能存在與蛋白質結合的果膠[35];一般說來,1300～800 cm-1的吸收峰譜圖反映了果膠中單糖的種類,1025.98 cm-1左右的吸收峰表明樣品中含有吡喃糖和呋喃糖[36];該圖譜在400～900 cm-1之間的吸收峰反映了其含有葡萄糖和甘露糖。

圖12 柿果膠的紅外光譜Fig.12 Fourier transform infrared spectra of the persimmon pectins

3 結論

本實驗以脫澀的柿果為材料,利用酸提醇沉法提取柿果膠,以響應面分析法確定柿果膠提取的最佳工藝參數:HCl提取液pH4.00,液料比23∶1 (g/g),提取時間107 min,提取溫度92 ℃。該條件下,果膠得率為7.31%。柿果膠為高酯化度果膠,果膠亮度L*為30.74,彩度C*為13.04,色度角h°為44.07,平均分子量405.3 kDa。柿果膠的主要單糖成分是半乳糖醛酸、葡萄糖和果糖,紅外光譜表明果膠可能是含有吡喃糖和呋喃糖的環狀結構。本研究為進一步探討柿果膠的組成與結構提供數據支持,同時也為柿果膠的開發及擴大應用提供初步理論依據,對現實生產具有一定的指導意義。

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