陳皮總黃酮提取及抑菌活性初探

王慧芳,邵圣娟,王 曼,孟戎茜,郭月艷,鄭佳楠,衛靜莉

(太原工業學院化學與化工系,山西太原 030008)

陳皮又名橘皮,分布于長江以南各地區,藥材分“陳皮”和“廣陳皮”,含有揮發油、橙皮甙、維生素B、C、E等營養成分[1-2]。陳皮中的黃酮類化合物主要有橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和桔皮素等[3],具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等作用,不但可用于降低膽固醇、預防動脈粥樣硬化等,還可作為保健因子添加到飼料和食品中,因此,從陳皮中提取黃酮類物質已成為人們研究的熱點[4-6]。目前,國內外學者提取陳皮黃酮方法主要有溶劑熱法、酶法、超聲、微波輔助法[7-8]等,其中,微波提取法因速度快、能耗低、溶劑用量少、選擇性高、污染小等優點而成為生物提取的有效方法之一[9]。陳皮的提取對象主要集中在橙皮苷、川陳皮素、多甲氧基黃酮等,都存在溶劑用量大、提取溫度高等問題,如:黃智等[10]比較了超聲法和微波輔助法提取陳皮中橙皮苷的工藝條件,兩種最佳工藝中的料液比均為1∶50 g/mL,逄顯娟等[11]采用溶劑熱法提取陳皮中橙皮苷的料液比為1∶70 g/mL,提取溫度為120 ℃。另外,科研工作者們還對陳皮黃酮的抗氧化性活性進行了較為全面、深入的研究[12],而其抑菌性能方面的研究則相對較少。

響應面法是目前常用的一種數據處理、分析方法,廣泛應用于生物、化工、醫學等領域[13-15]。本實驗采用BBD法優化了陳皮黃酮的微波提取工藝,從5種大孔樹脂中篩選出適宜的樹脂對陳皮粗提液中的總黃酮進行分離提純,并對純化后的黃酮進行抑菌活性研究,系統考查陳皮總黃酮的提取與抑菌活性,以期為深入研究陳皮黃酮產品的開發利用提供理論依據。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

陳皮 安徽省豪州市購于太原萬民藥房;蘆丁標準品，純度≥98% 上海金穗生物科技有限公司;茶多酚，純度≥98% 今品化學技術(上海)有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、濃鹽酸等，均為分析純 天津化學試劑廠;HP-20、HPD-100、AB-8、X-5、NKA-Ⅱ型大孔樹脂 鄭州華溢有限公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Tpb55菌株 中國普通微生物菌種保藏管理中心;金黃色葡萄球菌株(Staphylococcusaureus)ATCC26112 中國醫學菌種保藏中心。

XH-100A型微波催化合成/萃取儀 北京祥鵠科技;FA-2104型電子天平 上海舜宇恒平;722S型可見分光光度計 上海棱光;HHW-4-數顯恒溫水浴鍋 常州丹瑞;THZ-82恒溫振蕩儀 國華企業;DHP-9082型電熱恒溫培養箱 上海雷韻儀器;LDZX-30KBS型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安。

1.2 實驗方法

1.2.1 陳皮黃酮的提取 將陳皮干燥、粉碎、過篩(50目)后,秤取0.5 g陳皮粉加入到一定體積濃度的乙醇溶液中,室溫下靜置30 min,在一定溫度下微波輔助提取一定時間后,抽濾,得黃酮粗提液。提取液經旋轉蒸發儀于50 ℃下蒸出溶劑后,在30 ℃的恒溫干燥箱中干燥1 d得干品。

1.2.2 黃酮含量的測定

1.2.2.1 標準曲線的繪制 按姜昭等[16]的方法:繪制蘆丁標準曲線,回歸曲線方程為:y=8.517x+0.0062,R2=0.9992。

1.2.2.2 黃酮含量的測定 按標準曲線的方法測提取液的吸光度,并計算其含量。黃酮得率的計算見式1:

式(1)

1.2.3 單因素實驗 以黃酮得率為標準,考查微波功率、乙醇體積濃度、料液比、微波時間、提取溫度等五個因素對陳皮總黃酮得率的影響,每組實驗平行三次,取其平均值。

1.2.3.1 微波功率的篩選 取0.5 g陳皮粉于60%的乙醇溶液中,料液比(g/mL)1∶10,靜置30 min后,水浴加熱至50 ℃后,微波功率分別為:300、400、500、600、700、800 W,微波提取3 min,考察微波功率對陳皮黃酮得率的影響。

1.2.3.2 乙醇濃度的篩選 取0.5 g陳皮粉于不同乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)溶液中,料液比(g/mL)1∶10,水浴加熱至50 ℃后,微波功率600 W,微波時間3 min,考察乙醇濃度對陳皮黃酮得率的影響。

1.2.3.3 料液比的篩選 取0.5 g陳皮粉于60%的乙醇溶液中,不同料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30) g/mL,靜置30 min后,水浴加熱至50 ℃后,微波功率600 W,微波提取3 min,考察料液比對陳皮黃酮得率的影響。

1.2.3.4 微波時間的篩選 取0.5 g陳皮粉于60%的乙醇溶液中,料液比(g/mL)1∶10,靜置30 min后,水浴加熱至50 ℃后,微波功率600 W,微波提取1、2、3、4、5、6 min,考察微波時間對陳皮黃酮得率的影響。

1.2.3.5 提取溫度的篩選 取0.5 g陳皮粉于60%的乙醇溶液中,料液比(g/mL)1∶10,靜置30 min后,水浴加熱至不同溫度(30、40、50、60、70 ℃)后,微波功率600 W,微波時間3 min,考察提取溫度對陳皮黃酮得率的影響。

1.2.4 BBD實驗 根據單因素實驗結果,選取對陳皮黃酮得率影響較顯著的微波功率(A)、微波時間(B)、提取溫度(C)、液料比(D)四個單因素變量,進行四因素三水平BBD實驗設計,設計因素及水平見表1。

表1 BBD實驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels of BBD experiments

1.2.5 陳皮黃酮的純化 將HP-20型樹脂按崔蕊靜等[17]的方法預處理操作后,在上樣液pH=3.5、上樣液流速為2 mL/min、上樣液濃度為0.4 mg/mL、洗脫流速 2 mL/min、洗脫液乙醇體積濃度60%的條件下,對陳皮黃酮提取液進行吸附、解吸實驗,重復三次,計算純化后的陳皮黃酮干品。并按朱孔岳等[13]的方法,將純化后的陳皮黃酮干品與粗提物干品均配成1 mg/mL的溶液,在λ=510 nm處測定其吸光度,對照蘆丁標準曲線確定其純度。相關計算公式見式2:

式(2)

1.2.6 抑菌活性測試

1.2.6.1 菌種的擴培 用移液槍分別移取1 mL大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌種原液,注入50 mL BPDA培養基中,于30 ℃恒溫培養箱中培養12 h后冷藏備用。

1.2.6.2 抑菌活性實驗 純化后的陳皮黃酮干品與茶多酚均以95%乙醇為溶劑配制成不同濃度的溶液,采用濾紙片法[19]測試其抑菌活性,并設置無藥空白對照,以消除溶劑對測試結果的干擾,每組平行做3組,取平均值。在30 ℃恒溫培養箱中培養72 h后取出,用游標卡尺十字交叉測兩次抑菌圈直徑,取其平均值。抑菌圈直徑的測量方法見式3:

抑菌圈直徑=抑菌圈外徑-濾紙片直徑

式(3)

1.3 數據分析

采用Origin 7.0和SAS 9.2軟件進行數據處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 陳皮黃酮提取的單因素實驗

2.1.1 微波功率的篩選 由圖1可知,隨著微波功率的增大,微波的離子傳導作用增強,分子熱運動逐漸加強,陳皮的細胞膜被逐步破壞,黃酮浸出率增大,黃酮得率隨之增大,在微波功率600 W時達到最大。當功率再增大時,強烈的熱效應會造成黃酮的分解[20],從而導致黃酮得率下降,故選擇微波功率為600 W。

圖1 微波功率對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the yield of flavonoids

2.1.2 乙醇濃度的篩選 由圖2可知,陳皮中總黃酮得率隨乙醇濃度的增加而先增大后減小。原因在于:乙醇的極性與黃酮接近,隨著乙醇體積濃度的增大,陳皮黃酮逐漸被溶出,到乙醇濃度為60%時達到溶解平衡,黃酮得率最大1.21%。而當乙醇濃度繼續增大時,溶液滲透壓也隨之增大,其它雜質也會相繼溶出,導致黃酮得率迅速下降,故選擇乙醇體積濃度為60%。

圖2 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume on yield of flavonoids

2.1.3 料液比的篩選 由圖3可知,陳皮中總黃酮的提取得率隨料液比的變化規律也是先增大后減小。原因在于:隨著乙醇用量的增加,溶劑的傳質動力也隨之增加,有利于黃酮類化合物的溶出,當料液比為1∶20 g/mL時達到溶解平衡,黃酮得率最大。而當乙醇的量繼續增大時,其它雜質也會相繼溶出,導致黃酮得率迅速下降,且溶劑量過大也會給后處理帶來負擔,故選擇料液比為1∶20 g/mL。

圖3 料液比對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on yield of flavonoids

2.1.4 微波時間的篩選 由圖4可知,隨著微波提取時間的增加,微波的離子傳導作用以及分子熱運動逐漸加強,陳皮的細胞膜被逐步破壞,黃酮浸出率增大,在微波時間為3 min時達到最大,說明此時的陳皮黃酮已溶出完全。當微波時間再增加時,過量的分子熱運動和離子傳導作用會導致黃酮的分解,得率下降,故選擇微波提取時間為3 min。

圖4 微波時間對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave time on yield of flavonoids

2.1.5 提取溫度的篩選 由圖5可知,適當的升高溫度有利于破壞陳皮的細胞膜,提高陳皮中黃酮的浸出率,因此,總黃酮得率隨著提取溫度的升高而逐漸升高,在溫度為60 ℃時達到最高值,而當溫度過高(即超過60 ℃)時,會使溶出的黃酮結構發生變化,從而導致黃酮得率下降,故選擇提取溫度為60 ℃。

圖5 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of temperature on yield of flavonoids

2.2 BBD實驗

2.2.1 BBD實驗設計與結果 基于表1響應面設計進行的響應面實驗結果見表2。通過Design expert 8.0.5軟件進行響應面分析后得到以黃酮得率為響應值的回歸方程:

表2 BBD實驗設計結果Table 2 The design and results of BBD experiments

Y黃酮得率(%)=1.34+0.016A+0.012B+0.023C+0.043D+0.031AB+0.049AC+0.039AD+0.016BC+0.022BD+0.024CD-0.21A2-0.10B2-0.098C2-0.095D2

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

兩因素交互作用響應面圖見圖6。由圖6的等高線圖可以看出,微波功率與微波時間、微波功率與提取溫度以及微波功率與料液比之間的交互作用圖均為橢圓形,說明此三組交互項的交互作用顯著[12],且微波功率與提取溫度的交互作用比另兩組的交互作用更明顯,與表3中的模型顯著性結果一致。另外,響應面圖和等高線圖均在所選范圍內存在最高點,即極限值。

圖6 兩因素交互作用的響應面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of four factors interaction

2.2.3 最優條件驗證 經BBD實驗預測的最優條件為:微波功率619.30 W、提取時間3.12 min、提取溫度61.84 ℃、料液比1∶21.42 g/mL,此條件下陳皮黃酮得率最高為1.3575%。根據實際實驗水平，將反應條件修正為功率619 W、提取時間3 min、提取溫度62 ℃、料液比1∶21 g/mL,乙醇體積濃度60%,重復3次,取其平均值,黃酮得率為1.3468%±0.0142%,與預測值的偏差僅為0.0107%,進一步證實該模型方程與實際擬合良好。

2.3 抑菌活性測試結果

由表4可知,純化后的陳皮黃酮在濃度為1和0.5 mg/mL時對三種被測菌株均有不同程度的抑制作用,尤其是對大腸桿菌的抑菌效果最佳,其抑菌圈直徑明顯大于對照茶多酚,而對金黃色葡萄球桿菌的抑菌效果則相對差一些,但仍優于茶多酚,對枯草芽孢桿菌的抑菌效果則較茶多酚差。當濃度為0.25 mg/mL時,因濃度太低陳皮黃酮和茶多酚均檢測不到抑菌活性,由此可初步確定陳皮黃酮的最低抑菌濃度為0.5 mg/mL。

表4 純化后的陳皮黃酮與茶多酚的抑菌活性比較Table 4 Comparison of antimicrobial activity of purified citrus flavonoids with tea polyphenols

3 結論

本文采用BBD實驗模型對陳皮黃酮的提取工藝進行了優化,得到其最佳提取條件為:當提取劑乙醇體積濃度60%,微波功率619 W、微波時間為3 min、溫度62 ℃、料液比1∶21 g/mL時,陳皮黃酮得率最高1.3468%±0.0142%,與預測值的偏差僅為0.0107%,說明模型與實際契合度高。

抑菌活性實驗表明:純化后的陳皮黃酮對三種被測菌株均有不同程度的抑菌效果,其中,對大腸桿菌的抑菌效果最佳,對大腸桿菌和金黃色葡萄球桿菌的抑菌效果均優于對照茶多酚,可應用于食品防腐劑、水果保鮮等領域。

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