平陰玫瑰花托多糖的結構特征及抗氧化活性分析

馬耀宏,馬潤隆,鄭 嵐,*,楊 艷,楊俊慧,蔡 雷,劉慶艾,莊曉鳳,王業強

(1.齊魯工業大學(山東省科學院),山東省科學院生物研究所, 山東省生物傳感器重點實驗室,山東濟南 250103; 2.山東師范大學附屬中學,山東濟南 250014)

平陰縣是我國著名的“玫瑰之鄉”,因花色艷麗、瓣多而厚、香氣濃郁,而享譽世界[1-3]。目前,平陰玫瑰花產品不僅包括傳統的玫瑰干花瓣、玫瑰茶、玫瑰花醬、玫瑰餡料、玫瑰糖等初加工產品,先后開發了玫瑰精油、玫瑰細胞液、玫瑰超微粉、玫瑰保健品、玫瑰化妝品等多種精深加工產品[4]。隨著平陰玫瑰產業的發展壯大,玫瑰種植面積已達5萬畝,年產鮮花8000余t[5]。由于玫瑰花瓣是制作玫瑰食品、玫瑰細胞液、玫瑰超微粉等多種玫瑰產品的原材料,所以新鮮玫瑰花采摘后首先需要進行花瓣分選環節[6],從而產生了大量玫瑰花托廢棄物,造成了玫瑰花資源的極大浪費。玫瑰花是深受消費者青睞的食藥用珍惜資源,如何有效的利用玫瑰花托是玫瑰產業急需解決的問題。

玫瑰花具有理氣、活血、美容養顏、收斂等作用,主治月經不調、跌打損傷、肝氣胃痛、乳臃腫痛等癥[7-9]。多糖是食品、醫學界公認的生理活性物質,具有特定的保健功效[10],玫瑰花的主要功效成分是玫瑰花多糖[11-12],近年來對于玫瑰花多糖的提取工藝及其結構、活性已經進行了初步探索,但是對于玫瑰花托的研究還未見報道。本研究分別提取純化玫瑰花瓣及花托多糖,將其結構特征和抗氧化活性進行對比分析,從而為玫瑰花托提供新的研發角度和研發依據,這對于平陰玫瑰資源的綜合利用以及玫瑰產業鏈的延長具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平陰玫瑰花 由濟南惠農玫瑰花精油有限公司提供;乙腈(色譜純) 美國Fisher公司;標準單糖(葡萄糖、甘露糖、鼠李唐、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 美國Sigma公司;溴化鉀碎晶 美國Thermo公司;DEAE-52纖維素 英國whatman公司;其余試劑 均為國產分析純試劑。

LE204E型電子天平 特勒-托利多(Mettler Toledo)公司;JP-800C-6型中藥粉碎機 永康市久品工貿有限公司;SBS型數控記滴自動部分收集器、DHL-A型電腦數顯恒流泵 上海滬西儀器廠有限公司;凍干機 沈陽航天速凍設備制造有限公司;Spectra MR型酶標儀 美國Dynex公司;Agilent1260型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司(Agilent Technologies);Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 美國沃特斯公司;Thermo-Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Scientific)。

1.2 實驗方法

1.2.1 玫瑰花瓣及花托多糖的提取 將玫瑰的花瓣和花托分離,分別置于55 ℃烘箱中烘干,于中藥粉碎機中進行粉碎,并過80目篩。分別取玫瑰花瓣、花托粉末,將其與去離子水以1∶20比例混合,超聲波破碎(超聲功率為300 W,超聲時間為15 min),然后置于90 ℃水浴中2 h,離心(15000 r/min,10 min,4 ℃)取上清液[13]。按上述步驟提取3次,合并上清液。將玫瑰多糖提取液減壓濃縮至合適濃度,加入兩倍體積95%乙醇,靜置過夜,離心(15000 r/min,10 min,4 ℃),沉淀于55 ℃烘箱中烘干,并粉碎,獲得玫瑰花瓣及花托粗多糖。

1.2.2 玫瑰花瓣及花托多糖的純化

1.2.2.1 除色素 將粗多糖溶于適量去離子水中,按1%(m/v)比例加入活性炭,攪拌60 min,離心(14000 r/min,15 min)取上清液。

1.2.2.2 除蛋白 采用Sevag法除蛋白,按4∶1的體積加入Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1,v/v),充分振搖15 min,離心(8000 r/min,10 min),除去有機相及有機相與水相交界處的白色乳化層。如此重復10次,至乳化層消失為止,凍干待用,并分別命名為玫瑰花瓣多糖(RRP)及玫瑰花托多糖(RRR)。RRP或RRR的得率(%)=RRP或RRR的質量(g)/花瓣或花托粉末的質量(g)×100。

1.2.2.3 DEAE-52纖維素陰離子交換柱層析 將去蛋白后的RRP及RRR溶于適量去離子水中,用0.45 μm的微孔濾膜過濾,加5 mL樣品溶液于DEAE-52纖維素陰離子交換柱(2.6 cm×30 cm)中,用去離子水和0.05、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液進行洗脫,洗脫液的流速為1 mL/min。用全自動部分收集器收集洗脫液(2 mL/管),用苯酚-硫酸法逐管檢測,以管數為橫坐標,吸光度(A490 nm)為縱坐標繪制洗脫曲線。并將各洗脫組分凍干待用。組分的得率(%)=組分的質量(g)/RRP或RRR的質量(g)×100。

1.2.2.4 純度鑒定 用酶標儀對200～400 nm波段進行掃描,觀察280 nm處有無吸收峰來檢測蛋白是否去除干凈。

1.2.3 傅立葉紅外光譜(FT-IR)分析 取干燥的多糖樣品與KBr一起研磨均勻,用壓片模具制成透明薄片,用傅里葉變換紅外光譜儀進行紅外光譜測定,掃描范圍:4000～400 cm-1,分辨率:4 cm-1。

1.2.4 單糖組成分析 采用柱前衍生高效液相色譜法(HPLC)分析RRP、RRR及其組分的單糖組成。

1.2.4.1 多糖的水解 準確稱取待測樣品0.05 g于試管中,加入10 mL H2SO4(1 mol/L),封口并置于沸水浴中水解8 h。水解結束后,將水解液離心(10000 r/min,10 min,4 ℃),取上清液4.5 mL用NaOH(2 mol/L)中和至pH為7,并定容至10 mL,離心(10000 r/min,10 min,4 ℃)后取上清液待衍生化。

1.2.4.2 多糖的衍生化 分別取50 μL待測樣品及7種單糖(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖)的混合標準品溶液(2 mmol/L)與50 μL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液(0.5 mol/L)及50 μL NaOH(0.3 mol/L)混合均勻,將混合液置于恒溫水浴鍋中70 ℃反應30 min,冷卻至室溫后,加入50 μL HCl(0.3 mol/L)進行中和并加入100 μL高純水進行稀釋。混勻后向混合液中加入900 μL氯仿,渦旋混勻30 s隨后靜置5 min,吸取下層液棄去。重復操作3次,即得衍生化的樣品。每個樣品做3個平行實驗,用0.45 μm的微孔濾膜過濾,隨后進行高效液相色譜分析。

1.2.4.3 高效液相色譜條件 流動相:醋酸銨緩沖溶液(pH5.5)-乙腈(77∶23,v/v);柱溫:25 ℃;流速:1 mL/min;檢測波長:245 nm;進樣量:20 μL。

1.2.5 體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 羥基自由基清除能力 采用Fenton法進行羥基自由基清除能力的測定。將1 mL硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L),1 mL水楊酸乙醇溶液(9 mmol/L),1 mL多糖樣品溶液和1 mL過氧化氫溶液(8.8 mmol/L)于試管中混合均勻,37 ℃水浴30 min。離心(5000 r/min,10 min)后取上清液于510 nm處測定吸光度,并用BHT作為陽性對照。按照以下公式計算羥基自由基清除率(Scavenging rate,SR),SR(%)=(A0-A)/A0×100。其中,A0是去離子水+過氧化氫的吸光度,A是樣品+過氧化氫的吸光度。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力 取2 mL多糖樣品溶液于試管中,加入2 mL DPPH乙醇溶液(0.2 mmol/L),混合均勻后避光反應30 min,然后在517 nm處測定其吸光度,用BHT作為為陽性對照。清除能力SR(%)=[1-(A-A0)/A1]×100。其中,A為2 mL樣品溶液與2 mL DPPH乙醇溶液混合液的吸光度,A0為2 mL乙醇與2 mL樣品溶液混合液的吸光度,A1為2 mL去離子水與2 mL DPPH乙醇溶液混合液的吸光度。

1.3 數據處理

實驗數據采用Excel軟件作圖并進行數據統計分析,p<0.05為差異顯著標準。所有實驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 苯酚-硫酸法標準曲線

苯酚-硫酸法的標準曲線見圖1。

圖1 苯酚-硫酸法標準曲線Fig.1 Standard curve of phenol-sulfuric acid method

由圖1可見,苯酚硫酸法標準曲線的回歸方程為y=0.0085x-0.0055,R2=0.9993。玫瑰花瓣和玫瑰花托粉末中RRP和RRR的得率分別為3.22%和3.78%。RRP和RRR的多糖含量分別為94.12%和93.75%。

2.2 洗脫曲線

RRP和RRR的DEAE-52纖維素陰離子交換柱洗脫曲線見圖2、圖3。

圖2 RRP的DEAE-52纖維素離子交換柱洗脫曲線Fig.2 Elution curve of RRP on DEAE-52 cellulose column

圖3 RRR的DEAE-52纖維素離子交換柱洗脫曲線Fig.3 Elution curve of RRR on DEAE-52 cellulose column

由圖2、圖3可見,RRR、RRP的DEAE-52纖維素陰離子交換柱洗脫曲線較為相似,分別可以獲得三個組分,這3個組分命名為RRP-1、RRP-2、RRP-3和RRR-1、RRR-2、RRR-3,由去離子水、0.05 mol/L NaCl、0.1 mol/L NaCl洗脫獲得。RRP-1、RRP-2和RRP-3的得率分別為38.67%、29.03%、22.16%,RRR-1、RRR-2和RRR-3的得率分別為36.69%、24.48%、23.12%。

2.3 紫外掃描光譜

RRP及其組分(RRP-1,RRP-2和RRP-3)、RRR及其組分(RRR-1,RRR-2和RRR-3)的紫外掃描光譜見圖4。

圖4 紫外掃描曲線Fig.4 UV scanning spectrum注:A:RRP及其組分;B:RRR及其組分。

由圖4可見,RRP及其組分(RRP-1、RRP-2和RRP-3)和RRR及其組分(RRR-1、RRR-2和RRR-3)在280 nm處沒有吸收峰,說明蛋白質已經去除干凈。

2.4 FT-IR測定結果

RRP及其組分(RRP-1、RRP-2、RRP-3)、RRR及其組分(RRR-1、RRR-2、RRR-3)的FT-IR光譜圖見圖5和圖6。

圖5 FT-IR光譜圖Fig.5 FT-IR spectrum 注:A:RRP;B:RRP-1;C:RRP-2;D:RRP-3。

圖6 FT-IR光譜圖Fig.6 FT-IR spectrum注:A:RRR;B:RRR-1;C:RRR-2;D:RRR-3。

由圖5和圖6可見,RRP、RRR及其組分具有多糖的一般特征峰。在3500～3000 cm-1處的強寬吸收峰為O-H鍵伸縮振動形成。2900 cm-1附近處的吸收峰為C-H鍵伸縮振動峰。1735 cm-1附近出現的吸收峰是-COOH的C=O伸縮振動,可以說明糖醛酸的存在。在1616 cm-1處的吸收峰表明有C=O的伸縮振動。1400～1200 cm-1處出現的吸收峰表明有C-H邊角振動。在1200～1000 cm-1處的吸收峰是由糖環振動,C-OH側基的伸縮振動,C-O-C糖苷鍵振動相疊加所致。1100 cm-1處的吸收峰是C-O鍵伸縮振動形成的。FT-IR可以確定糖苷鍵的構型,糖α-和β-的端基差向異構體是由端基的C-H變角振動造成的,在吡喃糖苷鍵的構型中,α-型異構體C-H為平伏鍵,在(844±8) cm-1處有特征吸收峰,而β-型異構體C-H為直立鍵,在(891±7) cm-1處有特征吸收峰。另外,吡喃糖在1020～1180 cm-1處出現三個吸收峰,而呋喃糖在同一區域只出現兩個吸收峰。因此,RRP的構型主要為呋喃糖;RRP-1的構型為呋喃糖;RRP-2的構型為α-糖苷鍵連接的吡喃糖;RRP-3的構型為α-糖苷鍵連接的吡喃糖;RRR的構型主要為呋喃糖;RRR-1的構型為呋喃糖;RRR-2的構型為呋喃糖;RRR-3的構型為α-糖苷鍵連接的吡喃糖。RRP和RRR可以觀察到1735 cm-1左右的糖醛酸特征峰。

由此可見,RRR和RRP、RRR-1和RRP-1、RRR-3和RRP-3有著相同的構型,但是RRR-2和RRP-2的構型不同。

2.5 單糖組成

RRP及其組分(RRP-1,RRP-2、RRP-3)、RRR及其組分(RRR-1、RRR-2、RRR-3)的單糖組成見表1。

表1 單糖組成的摩爾比例關系Table 1 Mole ratio of monosaccharide composition

由表1可見,RRP含有7種單糖,其中葡萄糖含量最高,其次為阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸,而鼠李糖、葡萄糖醛酸、甘露糖含量較低。RRP-1含有4種單糖,葡萄糖是RRP-1的主要組分,而阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖的含量較低。RRP-2含有5種單糖,其中半乳糖含量最高,其次為阿拉伯糖、葡萄糖醛酸。RRP-3含有6種單糖,其中半乳糖含量最高,其次為半乳糖醛酸和阿拉伯糖。

RRR含有7種單糖,其中葡萄糖含量最高,其次為阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸,而鼠李糖、葡萄糖醛酸、甘露糖含量較低。RRR-1含有4種單糖,葡萄糖是其主要成分。RRR-2含有6種單糖,半乳糖是其主要成分,其次為阿拉伯糖、葡萄糖。RRR-3含有6種單糖,其中半乳糖醛酸含量最高,其次為半乳糖和葡萄糖。

因此,RRR和RRP由相同種類的單糖構成,但是各種單糖之間的摩爾比例關系不同。純化組分中RRR-1和RRP-1、RRR-3和RRP-3由相同種類的單糖構成,RRR-2和RRP-2由不同種類的單糖構成。

2.6 體外抗氧化能力分析

2.6.1 RRP及其組分的體外抗氧化能力 RRP及其組分RRP-1、RRP-2、RRP-3的羥基自由基和DPPH自由基的清除能力見圖7。

圖7 RRP及其組分RRP-1、RRP-2、RRP-3的抗氧化能力Fig.7 Anti-oxidant activities of RRP, RRP-1,RRP-2 and RRP-3 注:A:羥基自由基的清除能力;B:DPPH自由基的清除能力。

羥基自由基在體內的化學性質非常活潑,是一種危害性大、破壞性強的活性氧自由基。由圖7A可知,RRP及其組分RRP-1、RRP-2、RRP-3的羥基自由基清除能力呈現出明顯的量效關系。自由基的清除能力以EC50值表示,EC50值代表清除50%自由基的樣品濃度。RRP、RRP-1、RRP-2、RRP-3以及BHT的EC50值分別為725.20、540.95、771.79、657.06、624.23 mg/L,此時羥基自由基清除能力的強弱順序為RRP-1>BHT>RRP-3>RRP>RRP-2。而當多糖濃度達到1600 mg/L時,強弱順序變為BHT=RRP>RRP-3>RRP-1>RRP-2。

DPPH是一種很穩定的以氮為中心的自由基,廣泛應用于抗氧化物質的體外評價。由圖7B可知,隨著多糖樣品濃度的增加,DPPH自由基的清除能力逐漸增強。RRP、RRP-1、RRP-2、RRP-3以及BHT的EC50值分別為552.82、673.61、714.62、469.06、463.87 mg/L。因此,DPPH自由基清除能力的強弱順序為BHT>RRP-3>RRP>RRP-1>RRP-2。

2.6.2 RRR及其組分的體外抗氧化能力 RRR及其組分RRR-1、RRR-2、RRR-3的羥基自由基和DPPH自由基的清除能力見圖8。

圖8 RRR及其組分RRR-1、RRR-2、RRR-3的抗氧化能力Fig.8 Anti-oxidant activities of RRR, RRR-1,RRR-2 and RRR-3注:A:羥基自由基的清除能力;B:DPPH自由基的清除能力。

由圖8A可知,RRR及其組分RRR-1、RRR-2、RRR-3的羥基自由基清除能力呈現出明顯的量效關系。RRR、RRR-1、RRR-2、RRR-3以及BHT的EC50值分別為699.46、778.25、1017.65、695.69、624.23 mg/L,此時羥基自由基清除能力的強弱順序為BHT>RRR-3>RRR>RRR-1>RRR-2。而當多糖濃度達到1600 mg/L時,強弱順序變為RRR>BHT>RRR-3>RRR-1>RRR-2。

由圖8B可知,隨著多糖樣品濃度的增加,DPPH自由基的清除能力逐漸增強。RRR、RRR-1、RRR-2、RRR-3以及BHT的EC50值分別為514.31、722.45、789.23、600.15、463.87 mg/L。因此,DPPH自由基清除能力的強弱順序為BHT>RRR>RRR-3>RRR-1>RRR-2。

抗氧化實驗結果表明,RRP及其組分(RRP-1、RRP-2、RRP-3)、RRR及其組分(RRR-1、RRR-2、RRR-3)具備良好的體外抗氧化能力。RRR的抗氧化活性稍強于RRP。

3 結論

本研究分別將平陰玫瑰花瓣多糖(RRP)和花托多糖(RRR)分離純化為3個組分(RRP-1、RRP-2、RRP-3和RRR-1、RRR-2、RRR-3),并進行結構和抗氧化能力的對比分析。結構分析表明RRR的單糖組成為葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖醛酸、甘露糖(24.01∶14.57∶11.50∶9.77∶5.5∶1.09∶1),構型主要為呋喃糖。RRR和RRP由相同種類的單糖構成,但是各種單糖之間的摩爾比例關系不同。純化組分中RRR-1和RRP-1、RRR-3和RRP-3由相同種類的單糖構成,并且構型相同。RRR-2和RRP-2的結構略有差異。抗氧化實驗表明,RRR和RRP均具有較強的抗氧化活性,RRR清除羥基自由基和DPPH自由基的EC50值分別為699.46、514.31 mg/L。因此,平陰玫瑰花托多糖具有良好的抗氧化特性,可以開發成為抗衰老保健食品及玫瑰化妝品。

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