猴頭菇多糖的乙酰化修飾及其抗氧化活性研究

徐 兵,王華麗,林曉穎,陳義勇

(常熟理工學院,生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500)

猴頭菇(Hericiumerinaceus,HE)是一類罕有珍稀的藥用菌,其子實體外形象猴子的頭,味美可食,富含多種營養成分,并且還含有16種氨基酸,其中有8種為人體必需氨基酸,并且比例與人體需要的氨基酸相接近[1-2]。猴頭菇多糖(HEP)可以控制細胞分裂速度,調控細胞分裂,衰老程度,經研究發現,可以用作免疫促進劑[3]。同時,猴頭菇多糖還具有降低血糖血脂[4]、促進胃的健康[5]、提高免疫力[6]等生理作用,用其制成的醫藥保健品及功能性食品深受消費者喜愛,具有廣闊的市場前景[7]。

乙酰化修飾是糖類物質的一種常見的修飾方法。目前,多糖的乙酰化修飾的研究主要集中在靈芝多糖[8]、南瓜多糖[9]、青錢柳葉多糖[10]、松樹蕈多糖[11]等,對猴頭菇多糖的研究僅限于提取、純化方面[12-13],關于對其乙酰化修飾的研究還未見報道。為此,本文對猴頭菇多糖乙酰化修飾進行研究探討。研究料液比(多糖與乙酸酐的比例,g/mL)、反應溫度以及反應時間對多糖乙酰化修飾的影響。在單因素實驗基礎上采用響應面分析法對乙酰化工藝進行優化,并探討乙酰化猴頭菇多糖的抗氧化活性,旨在為猴頭菇多糖在保健食品領域應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇 東北黑龍江海成科技有限公司;乙酸酐、NaOH、濃鹽酸、無水乙醇、DPPH、水楊酸、NaNO2、雙氧水、硫酸亞鐵、硝酸鈉等 以上試劑均為國產分析純。

RE-52A型旋轉蒸發儀 上海亞榮儀器廠;HH-22型恒溫數顯水浴鍋 金壇杰瑞爾有限公司;HK-20B型 1000 g搖擺式高速粉碎機 廣州旭朗機械設備有限公司;722型分光光度計 上海金華科技儀器有限公司);Z326K型離心機 Hermle labor technik;DFS-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義予華儀器有限公司;DHG-P030A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海三發儀器有限公司;FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;NICOLET 380傅立葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 猴頭菇多糖的提取 將猴頭菇置入30 ℃鼓風干燥箱干燥,粉碎,過40目篩。取50.0 g猴頭菇粉,按固液比1∶40 g/mL加入2 L蒸餾水,80 ℃水浴4 h得到猴頭菇的初提液,經4500 r/min離心10 min,取上清液,經Sevag法脫蛋白、過氧化氫脫色得到洗脫液,將洗脫液旋蒸至一定體積,以1∶4的比例加入無水乙醇進行醇沉,靜置12 h,經10000 r/min離心10 min,取沉淀,在40 ℃條件下恒溫鼓風干燥24 h,取出后研磨成粉狀,過60目篩,即為HEP樣品,經苯酚-硫酸法測定[14-15],以葡萄糖濃度為橫坐標,OD490為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.2 猴頭菇多糖的乙酰化 參照梁少茹等的研究[16],精確稱取HEP樣品0.5 g加入燒杯中,加入10 mL蒸餾水充分混勻,用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至9.0,在恒溫下保持一定的時間,然后分別向HEP溶液中加入一定量的乙酸酐,并且用0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液保持pH為8.0,恒溫反應一定時間。待反應完成后,用濃度為5 mol/L的鹽酸調節反應液pH至7.0,待冷卻后將反應液置于截留分子量為15000的透析袋中,流水透析48 h后將透析液置于旋轉蒸發儀減壓濃縮,用4倍95%乙醇醇沉24 h,沉淀經冷凍干燥后即得到乙酰化猴頭菇多糖。

1.2.3 猴頭菇多糖乙酰化取代度的測定 根據劉瑩等[17]的研究,采用酸堿滴定法測定猴頭菇多糖乙酰化取代度。準確稱取10 mg乙酰化猴頭菇多糖放入100 mL燒杯中,用10 mL 0.01 mol/L的氫氧化鈉標準溶液溶解。以酚酞作為指示劑,用0.01 mol/L標準鹽酸溶液反滴定至紅色消失,記錄加入鹽酸的體積。取代度(DS)按下式計算[18]:

式中:A為乙酰基含量,%;V0為加入氫氧化鈉溶液的體積,mL;C0為氫氧化鈉溶液的濃度(0.01 mol/L);V1為消耗鹽酸溶液的體積,mL;C1為鹽酸溶液的濃度(0.01 mol/L);m為乙酰化猴頭菇多糖樣品質量,g。

1.2.4 猴頭菇多糖乙酰化修飾的單因素實驗

1.2.4.1 料液比對猴頭菇多糖乙酰化修飾的影響 精確稱取0.1 g HEP,反應時間35 ℃,保持反應液 pH為8.0反應時間3 h,分別考察料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40 g/mL對HEP乙酰化反應的影響,確定適宜的料液比。

1.2.4.2 反應時間對猴頭菇多糖乙酰化修飾的影響 精確稱取0.1 g HEP,反應溫度40 ℃,乙酸酐3.5 mL,保持反應液 pH為8.0,分別考察反應時間2、2.5、3、3.5 和4 h對HEP乙酰化反應的影響,確定適宜的反應時間。

1.2.4.3 反應溫度對猴頭菇多糖乙酰化修飾的影響 精確稱取0.1 g HEP,乙酸酐3.5 mL,反應時間3 h,保持反應液 pH為8.0,分別考察溫度25、30、35、40和45 ℃對HEP乙酰化反應的影響,確定適宜的反應溫度。

1.2.5 猴頭菇多糖乙酰化修飾工藝條件優化 在單因素實驗基礎上,根據Box-Behnken 的中心組合實驗設計原理,以取代度為指標,選取料液比(A)、反應時間(B)和反應溫度(C)三個主要因素進行響應面設計優化猴頭菇多糖乙酰化修飾工藝條件,實驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面實驗因素水平Table 1 Level and code of independent variable used for response surface analysis

1.2.6 乙酰化猴頭菇多糖的紅外結構表征 充分干燥的乙酰化猴頭菇多糖與KBr一起充分研磨,并取適量壓片,用紅外光譜儀在4000～400 cm-1范圍內進行紅外線光譜掃描,同時與修飾前猴頭菇多糖的紅外光譜圖進行比較。

1.2.7 抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH自由基清除率的測定 根據宋逍等[19]的研究,取不同濃度的(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)HEP樣品溶液2 mL,加入2 mL現配的DPPH-乙醇溶液(0.1 g/mL)2 mL,作為樣品管,混勻后常溫避光30 min,在517 nm波長處測定溶液OD值,記錄數據A1;用蒸餾水代替HEP溶液重復以上操作,在517 nm處測得吸光度值,記錄數據A0;用蒸餾水代替DPPH-乙醇溶液,重復上述操作,測得吸光度數據為B1。

DPPH自由基清除率公式為:

式中:A1為加入不同濃度HEP溶液的吸光度;A0為空白組的吸光度;B1為不同濃度HEP不加DPPH-乙醇溶液的吸光度。

1.2.7.2 羥基自由基清除率的測定 根據王之珺等[20]的研究,各取1.2.7.1中配制好的不同濃度的HEP樣品溶液1 mL,先后加入FeSO4(9 mmol/L)溶液1 mL,水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)1 mL,H2O2溶液(9 mmol/L)1 mL,37 ℃水浴加熱,30 min 后,在波長為510 nm處測定OD值,記錄數據A1;用蒸餾水代替HEP溶液重復以上操作,在510 nm處測定OD值,記錄數據A0;用蒸餾水替代H2O2溶液重復上述操作,測得吸光度數據為B1。

羥基自由基清除率公式為:

式中:A1為加入不同濃度HEP溶液的吸光度;A0為空白組的吸光度;B1為不加H2O2溶液不同濃度HEP的吸光度。

式中:V1為加多糖樣品后清除超氧陰離子的速率;V0為鄰苯三酚自氧化速率。

1.3 數據處理

所有實驗數據均為3次重復實驗的平均值,并以平均值±標準差表示,實驗數據用Design Expert 8.0.5以及Microsoft Office Excel進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 猴頭菇多糖含量

根據標準曲線測定多糖含量(圖1),獲得回歸方程:y=0.0050x+0.0155,R2=0. 9931。經測定猴頭菇多糖含量為10.89%。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

2.2 單因素對猴頭菇多糖乙酰化修飾的影響

2.2.1 料液比對猴頭菇多糖乙酰化取代度的影響 料液比對猴頭菇多糖乙酰化取代度的影響結果見圖2。

圖2 料液比對猴頭菇多糖乙酰化取代度的影響Fig.2 Effect of polysaccharides-to-acetic anhydrideratioon substitution degree of HEP

由圖2可知,隨著料液比的減少,HEP乙酰化取代度有一定程度增加,當料液比為1∶35 (g/mL)時,取代度達到最大值,乙酰化效果最好。當料液比進一步減少,水解副反應增加,反應體系取代度反而下降,這主要是因為生成的乙酰化多糖對反應起抑制作用導致,因此確定最適宜料液比為1∶35 (g/mL)。

2.2.2 反應時間對猴頭菇多糖乙酰化取代度的影響 反應時間對猴頭菇多糖乙酰化取代度的影響結果見圖3。

圖3 反應時間對猴頭菇多糖乙酰化取代度的影響Fig.3 Effect of the reaction time on substitution degree of HEP

由圖3可知,反應時間在1～3 h時,乙酰取代度隨反應時間的增加而增加;在3 h時取代度達到最大為0.593,此時乙酸酐與HEP完全反應,乙酰化效果最好;超過3 h時,取代度下降,可能是由于反應時間過長,部分乙酰化多糖的乙酰基游離出來,使取代度降低[17],因此確定最適宜反應時間為3 h。

2.2.3 反應溫度對猴頭菇多糖乙酰化取代度的影響 反應溫度對猴頭菇多糖乙酰化取代度的影響結果見圖4。

圖4 反應溫度對猴頭菇多糖乙酰化取代度的影響Fig.4 Effect of the reaction temperature on substitution degree of HEP

由圖4可知,反應溫度在25～30 ℃時,取代度遞增;30 ℃時取代度達到最大值;超過30 ℃時,取代度隨溫度升高降低,原因是溫度升高使乙酸酐的水解速度加快,乙酰基與多糖的結合力降低,導致取代度下降[18]。因此確定最適宜反應溫度為30 ℃。

2.3 響應面分析

2.3.1 響應面優化實驗分析 為了確定猴頭菇多糖乙酰化修飾的最優工藝條件,利用3因素3水平響應面分析法優化猴頭菇多糖乙酰化工藝參數。選取料液比、反應時間和溫度三個考察因素,以乙酰化取代度DS作為響應值,進行三因素三水平的實驗設計。用Design-expert軟件對17個實驗點的取代度進行數據處理,從中發現各影響因素對修飾的HEP取代度的影響,找到各因素作用的最優區域,實驗結果見表2,方差分析結果見表3。

表2 實驗方案與結果分析Table 2 Design and results of tests

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

通過對響應面優化實驗的結果進行分析研究,三個因素經擬合,得到的多糖取代度的回歸方程為

Y=0.59-0.036A+0.000875B-0.011C-0.028AB+0.021AC+0.00675BC-0.11A2-0.11B2-0.087C2

由表3方差分析可以看出,模型p小于0.05,說明模型有意義。失擬項p值為0.0917>0.05,失擬項差異不顯著,表明干擾因素較小。相關系數R2=0.9047,表明超過90%的實驗數據可用該模型進行解釋,說明該方程可靠性較高。影響HEP乙酰化因素的主次順序依次為A>C>B,即料液比>反應溫度>反應時間。

2.3.2 響應面圖分析 通過響應面實驗得到響應面圖,更直觀地反映各因素交互作用對猴頭菇多糖乙酰化取代度影響的強弱關系。各因素交互作用影響的響應面圖見圖5。

圖5 兩因素交互作用對取代度的影響Fig.5 Effects of cross-interaction of two factors on substitution degree of Ac-TMP

由圖5可知:料液比對乙酰化取代度的影響最大,表現為曲線最陡;溫度的影響次之,而圖中時間曲線最平滑,因此影響最不顯著。料液比和時間的交互作用最明顯,料液比和溫度的交互作用次之,時間和溫度的交互作用不太明顯,但都不顯著。

2.3.3 最佳條件的確定及驗證實驗 利用Design-Expert 8.06軟件對工藝參數進行優化,得到的最佳工藝條件為:料液比為1∶34.1 g/mL,反應時間3.01 h,溫度為29.59 ℃時,猴頭菇多糖乙酰化取代度最大為0.612。考慮實際操作,調整工藝參數料液比為1∶34 g/mL,反應時間3 h,反應溫度30 ℃,在此條件下測得猴頭菇多糖乙酰化的取代度為0.609,與預測值十分接近,表明該實驗的最佳優化條件合理可行。

2.4 紅外結構表征分析

乙酰化修飾前后猴頭菇多糖紅外光譜見圖6和圖7。

圖6 HEP的紅外光譜Fig.6 Infrared spectra of HEP

圖7 A-HEP的紅外光譜Fig.7 Infrared spectra of A-HEP

由圖6和圖7可見修飾前后的猴頭菇多糖均具有多糖類物質紅外的特征吸收峰:如圖6,在1401.58 cm-1顯現了多糖物質的特征吸收,表明該物質即為猴頭菇多糖。同樣,如圖7所示,乙酰化猴頭菇多糖在1640.28 cm-1出現了一個吸收峰,為酯基C=O雙鍵的伸縮振動,在1398.14 cm-1處有C-O單鍵的伸縮振動,說明乙酰化產物中成功引入了乙酰基。

2.5 抗氧化活性檢測

2.5.1 DPPH自由基清除能力 修飾前后猴頭菇多糖對DPPH·的清除作用見圖8。

圖8 HEP和A-HEP對DPPH·的清除作用Fig.8 Scavenging capacity of HEP and A-HEP on DPPH free radicals

由圖8可知,HEP和A-HEP在多糖濃度0.2～0.6 mg/mL范圍內,清除率隨多糖濃度增加而明顯提高,而當多糖濃度大于0.6 mg/mL的時候,A-HEP對DPPH·的清除有明顯變緩的趨勢。HEP的最大清除率為18.7%,A-HEP最大清除率為22.8%,乙酰化后的HEP對DPPH·的清除能力略有增強。

2.5.2 羥基自由基清除能力 修飾前后猴頭菇多糖羥基自由基清除能力結果見圖9。

圖9 HEP和A-HEP對·OH的清除作用Fig.9 Scavenging capacity of HEP and A-HEP on hydroxyl free radicals

由圖9可知,在所選多糖濃度范圍內HEP和A-HEP對·OH的清除作用均隨濃度升高而增強,與HEP相比A-HEP對·OH的清除能力顯著增強,A-HEP的清除率最大為42.8%,而HEP清除率最大為23.7%,表明了對HEP進行乙酰化修飾能提高其對·OH的清除能力。

2.5.3 清除超氧陰離子能力 修飾前后猴頭菇多糖對超氧陰離子清除能力的影響結果見圖10。

圖10 HEP和A-HEP對超氧陰離子清除作用Fig.10 Scavenging capacity of HEP and A-HEP on superoxide anion free radicals

由圖10可知,不同濃度下的A-HEP對超氧陰離子的清除作用都遠遠大于相同多糖濃度下HEP的清除作用,HEP的最大清除率為17.2%,A-HEP的最大清除率為30.2%,表明對HEP進行乙酰化修飾能提高超氧陰離子的清除作用。

對修飾前后猴頭菇多糖抗氧化活性研究表明:猴頭菇多糖經過乙酰化修飾后抗氧化活性有了明顯增強,可能是因為猴頭菇多糖經乙酰化修飾后,其空間構象發生變化,使其更易于提供羥基,從而有利于捕捉自由基,提高抗氧化活性。

3 結論

本文以猴頭菇為原料,采用傳統水提法提取猴頭菇多糖,采用乙酸酐法對HEP進行乙酰化修飾,以乙酰基取代度為指標,通過響應面分析對HEP乙酰化修飾工藝參數進行優化,并比較修飾前后HEP的抗氧化活性。確定了猴頭菇多糖乙酰化修飾的最佳工藝條件為:料液比1∶34 g/mL,反應時間3 h,反應溫度30 ℃,在最佳修飾工藝條件下,猴頭菇多糖乙酰化的取代度為0.609。利用該方法對多糖進行乙酰化修飾,具有反應可操作性強、試劑便宜易得、多糖的乙酰化取代度較高的優點,是一種較理想的能夠有效提高猴頭菇多糖抗氧化活性的一種修飾方法。

抗氧化性研究表明:HEP和A-HEP對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基均有一定的清除作用,且清除率隨多糖濃度增加而增大。與HEP相比,A-HEP抗氧化活性明顯增強。本研究表明乙酰化修飾可以提高猴頭菇多糖的抗氧化活性,可用于猴頭菇多糖的結構改性,為其構效關系研究提供新的方向和思路。

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