綠原酸抑制豬肉肌原纖維蛋白氧化及NDEA生成的作用研究

李 玲,季 慧,段家玉

(臨沂大學生命科學學院,山東臨沂 276000)

肉類食品在貯藏過程中,蛋白質容易受到自由基的攻擊而發生氧化,隨后發生一系列的物理化學變化,引起品質劣變[1-2]。羥自由基是眾多自由基中氧化能力最強的自由基,也是引起蛋白質和脂肪發生氧化的主要貢獻者,蛋白質多肽鏈的主鏈及側鏈受到自由基的攻擊而引起結構的變化,影響其表面疏水性及羰基和巰基的含量,進而影響蛋白質的凝膠保水性,破壞肉制品的質地、口感和滋味等[3-4]。天然植物多酚作為抗氧化劑,近年來廣泛應用于肉類食品的加工過程中,在蛋白質氧化體系中,多酚和蛋白質以共價鍵或者非共價鍵結合,從而影響蛋白質的結構和功能[5-7]。目前,人們對蛋白質氧化的研究有限,對自由基氧化和多酚抗氧化對蛋白質結構的影響研究較少。亞硝胺是一類具有致癌作用的化合物,在體內外都可以生成,在肉品加工的高溫環境中更有利于亞硝胺的產生[8-9],因此合理控制亞硝胺的生成是近年來的研究熱點,特別是在蛋白質氧化體系中研究多酚對亞硝胺生成的影響。本實驗選用綠原酸作為抗氧化劑,利用Fenton氧化體系產生的羥自由基,探討自由基誘導的肌原纖維蛋白氧化后其理化性質的變化,以及氧化蛋白體系中亞硝胺形成的規律,以期為多酚的應用提供更多理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬背最長肌 冷鮮肉購自臨沂東方購物中心;N-亞硝基二乙胺標準品(NDEA) 美國Sigma公司;色譜純甲醇、二氯甲烷 美國Tedia公司;哌嗪-N,N′-二(2-乙磺酸)(PIPES)、溴酚藍、鹽酸胍、綠原酸(98%) solarbio 公司;二乙胺、鹽酸二乙胺、二甲亞砜、DNPH(2,4-二硝基苯肼)、DTNB(5,5′二硫代雙(2-硝基苯甲酸))、三羥甲基氨基甲烷(Tris)水溶性維生素E(trolox) 購自阿拉丁試劑;亞硝酸鈉、磷酸鹽、對氨基苯磺酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、雙氧水、三氯乙酸(TCA)等 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

Agilent 1260液相色譜系統配紫外檢測器、ZORBAX SB-C18反相柱(4.6×250 mm,5 μm) 美國Agilent公司;Allegra 25R高速冷凍離心機 美國Beckman公司;F-4600熒光分光光度計 日本日立公司；H-S4數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠;優普UPW系列超純水器 成都超純科技有限公司;SANYO SIM-F124制冰機 日本三洋公司;Spectrum紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;BS223S電子太平 北京塞多利斯儀器;有機系一次性微孔濾膜(0.22 μm) 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 取宰后24 h的豬背最長肌,去除筋膜和可見脂肪組織,沿垂直肌纖維方向切成100 g左右的肉塊,用聚乙烯袋包裝后于-18 ℃凍藏。臨用前將冷凍的豬肉置4 ℃解凍4 h備用。

1.2.2 肌原纖維蛋白(MP)的制備 參考Park[3]、Feng[6]的方法,并做一定修改。稱取50 g肉樣,加4 倍體積的pH7.0緩沖液勻漿(10000 r/mim,30 s),4 ℃離心(3000 r/min,10 min),棄上清液,重復3遍。再加入4倍體積的0.1 mol/L NaCl洗液,勻漿(10000 r/mim,30 s)4 ℃離心(3000 r/min,10 min),棄上清液,重復2次。第3次加洗液勻漿后,用兩層紗布過濾以除去結締組織等,最后用0.1 mol/L HCl調pH為6.25后離心去上清液,所得膏狀物為肌原纖維蛋白。

將制備好的MP,冰浴保存,48 h之內使用。采用雙縮脲法測定蛋白的含量,以牛血清白蛋白(BSA)為標準蛋白制作標準曲線,y=0.027x+0.08,R2=0.995。

1.2.3 綠原酸的添加及氧化處理 綠原酸用DMSO配制10 mmol/L的溶液。用15 mmol/L PIPES緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH6.25)將MP蛋白膏稀釋為40 mg/mL,試管中先加入蛋白溶液,再加入不同量的綠原酸溶液,攪拌均勻后加入fenton氧化體系(終濃度0.01 mmol/L FeCl3,0.1 mmol/L抗壞血酸,10 mmol/L H2O2)4 ℃氧化12 h。MP的終濃度是20 mg/mL,綠原酸的終濃度分別是0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0 mmol/L。以未加綠原酸和氧化劑但有trolox的蛋白溶液作為對照組。氧化反應通過添加trolox終止反應(終濃度1 mmol/L)。

1.2.4 肌原纖維蛋白物理化學變化的測定 羰基含量的測定采用DNPH法,參照Oliver[10]的方法進行;游離巰基和總巰基含量按照Xia X等[11]的方法進行測定;疏水性測定采用溴酚藍(BPB)結合法進行,參照曹云剛[12]描述的方法進行測定;內源色氨酸熒光的變化通過F-4600熒光分光光度儀檢測,用15 mmol/L PIPES緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH6.25)將樣品稀釋為蛋白濃度0.1 mg/mL,吸取0.1 mL置于石英比色皿中,室溫條件下于283 nm激發,記錄下300～400 nm的發射光譜供后續分析。激發和發射狹縫寬度均設置為 5 nm,電壓700 V。

1.2.5 二乙基亞硝胺(NDEA)的測定 采用Agilent1260液相色譜系統,ZORBAX SB-C18反相柱(4.6×150 mm,5 μm),流速1 mL/min,進樣量20 μL,流動相甲醇/水=35/65,柱溫30 ℃,檢測波長230 nm。用蒸餾水分別配制0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/mL的NDEA標準溶液。利用最優檢測條件,從低濃度依次進樣分析測定,繪制NDEA標準工作曲線,y=59.69x+0.59,R2=0.991。

吸取1 mL氧化處理好的MP溶液,置于5 mL塑料離心管中,再加入0.1 mL 100 mmol/L的NaNO2溶液(用上述0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制),0.1 mL 1 mol/L的二乙胺溶液(用上述0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制),0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液0.8 mL,渦旋混合調節pH至3.0,分別采用37 ℃水浴反應4 h和80 ℃水浴反應1 h,反應結束后迅速冷卻,加入0.1 mL 100 mmol/L的對氨基苯磺酸混勻終止反應,離心(3000 r/mim,5 min)。上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾后,在上述液相色譜條件下進行測定。

1.3 數據統計分析

所有數據均用Excel建立工作表,用SPSS 18.0統計軟件進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 綠原酸濃度對于MP蛋白羰基含量的影響

蛋白質的側鏈氨基酸在某些特定條件下極易發生氧化,羰基含量是判斷蛋白質氧化程度的重要指標。一般羰基含量越高,蛋白質氧化程度越高。如圖1可見,未氧化的對照組MP羰基含量為2.98 nmol/mg蛋白,羥自由基氧化12 h未添加綠原酸組羰基升高到5.75 nmol/mg蛋白,升高了1.93倍。而綠原酸的添加抑制了羰基的生成,在0.1～0.5 mmol/L的綠原酸添加組與未添加綠原酸組相比差異顯著(p<0.05),而0.8和1 mmol/L的綠原酸組與未添加綠原酸組相比差異不顯著(p>0.05)。這可能是因為綠原酸中羥基含量較高,具有一定的清除自由基和螯合金屬離子的作用[13]。有關酚類物質抑制蛋白質羰基形成的作用,前人研究發現0.1%質量分數的鞣酸和沒食子酸具有抑制豬肉肌原纖維蛋白羰基形成的作用[7]。Estévez[13]研究發現沒食子酸在低劑量時可以抑制豬肉糜蛋白羰基的產生,而高劑量會促進蛋白質的氧化。酚類物質(綠原酸和沒食子酸)既能促進也能抑制肌原纖維蛋白羰基的生成,可能是與酚類物質的結構、濃度和氧化條件有密切關系[12]。

圖1 綠原酸對肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effect of Chlorogenic acid on the carbonyl content of MP after oxidation

2.2 綠原酸濃度對于MP巰基含量的影響

綠原酸對氧化MP巰基含量的影響見圖2。從圖中可見,與對照組相比,不加綠原酸的氧化組游離巰基含量增加了11.7%,差異顯著(p<0.05),說明氧化使蛋白質結構展開,巰基暴露,導致檢測到更多的游離巰基。隨著綠原酸含量的增加,游離巰基含量進一步升高,可能是綠原酸保護了氧化過程中展開的游離巰基,導致其含量繼續增加。在20種氨基酸中,半胱氨酸和甲硫氨酸含有硫原子,最易受自由基引起的氧化修飾。與對照組相比,氧化后總巰基含量增加了21.3%,差異顯著(p<0.05)。添加綠原酸后,總巰基含量進一步升高,其中0.1、0.2、0.8 mmol/L的綠原酸與未添加組差異顯著(p<0.05),而0.5、1.0、2.0 mmol/L的綠原酸與未添加組差異不顯著(p>0.05),本研究認為高濃度的綠原酸抑制了體系中的總巰基含量。前人在研究羥自由基誘導豬肉肌原纖維蛋白氧化的過程中發現,氧化處理及添加綠原酸后減少了體系中的總巰基含量[12]。Xiong G等[14]在研究草魚肌原纖維蛋白凍藏過程中的變化時,發現隨冷凍時間的延長,總巰基和游離巰基含量逐漸降低。而本研究中,巰基含量增加,其原因可能與氧化劑與抗氧化劑(綠原酸)的濃度比例不同有關,有待于對其進一步探討。

圖2 綠原酸對肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig.2 Effect of Chlorogenic acid on the sulfhydral content of MP after oxidation

2.3 綠原酸濃度對于MP表面疏水性的影響

在肌原纖維蛋白氧化過程中,自由基攻擊蛋白質的多肽鏈,使原本位于內部的疏水性肽段暴露,導致蛋白質表面疏水性氨基酸含量的變化。蛋白質表面疏水性可以通過測定BPB結合量來表示,BPB分子可以結合在蛋白質分子表面的疏水性結合位點,疏水性增加是蛋白質分子結構展開的一個重要指標。如圖3所見,與對照組相比,氧化后的MP疏水性達到3.74 ng,差異顯著(p<0.05),說明MP結構展開,其疏水性顯著升高。胡忠良等[1]的研究發現,隨著氧化劑濃度的增加,表明疏水性顯著增大,更多的疏水氨基酸暴露在分子表面。當添加綠原酸后,0.1 mmol/L組與未添加綠原酸組相比,差異不顯著。但是0.2～2.0 mmol/L的綠原酸組,與未添加綠原酸組相比,差異顯著(p<0.05)。高濃度的綠原酸促進了氧化誘導的MP結構的進一步展開,疏水性升高。Li等[15]的研究表明,在羥自由基氧化體系中,隨氧化劑濃度和時間的增加,MP的表面疏水性增加。有研究表明,在肌原纖維蛋白中添加不同濃度的沒食子酸,表明疏水性持續增加,高濃度沒食子酸作用效果更明顯,與本實驗的結果一致,說明其促進了蛋白質結構的展開[16]。

圖3 綠原酸對肌原纖維蛋白疏水性的影響Fig.3 Effect of Chlorogenic acid on the surface hydrophobicity of MP after oxidation

2.4 綠原酸濃度對MP內源色氨酸熒光的影響

由圖4綠原酸對MP內源色氨酸熒光強度的變化可見,對照組中,發射波長334 nm時,最大熒光強度為8649。與對照組相比,氧化處理后,色氨酸熒光強度明顯降低。隨著綠原酸添加量的增加,熒光強度逐漸降低,0.8 mmol/L的綠原酸組,最大熒光強度紅移到337 nm。而2.0 mmol/L的綠原酸組,出現大范圍的熒光猝滅,最大熒光強度紅移到367 nm。其原因可能是蛋白質中的氨基酸殘基色氨酸對其周圍微環境的極性非常敏感,當蛋白質處于折疊狀態時,色氨酸殘基主要位于蛋白質內核的疏水環境中,此時被激發的色氨酸具有相對較高的熒光強度和較低的發射波長;而當蛋白質部分或全部展開后,色氨酸殘基會有更多的暴露在蛋白質分子表面的極性環境中,此時被激發的色氨酸熒光強度降低,發射波長較長(紅移)。與此類似,Cao等[5]也報道了綠原酸會導致MP色氨酸熒光強度降低,與本研究結果一致。Wu等[17]研究發現,表沒食子酸兒茶素(EGC)和β-乳球蛋白結合過程中,EGC覆蓋在β-乳球蛋白表面,引起蛋白結構變化,a-螺旋含量略有升高,色氨酸熒光強度降低。

2.5 綠原酸濃度對氧化蛋白體系中亞硝基二乙胺生成的影響

在肌原纖維蛋白氧化條件下,圖5分析了NDEA的變化趨勢。圖中分別表示了37 ℃保溫4 h和80 ℃保溫1 h的數據。從圖5可見,同一組處理在80 ℃保溫1 h后,NDEA的生成量要大于37 ℃保溫4 h的生成量,說明高溫能促進了亞硝胺的生成。這與前人對羥自由基氧化體系中亞硝基二甲胺(NDMA)和NDEA的研究結果一致[18-19]。與對照組相比,氧化后NDEA的含量有所升高。當添加綠原酸后,NDEA的生成量增加,特別是0.8 mmol/L綠原酸組80 ℃保溫1 h,NDEA的含量達到3.72 μg/mL,此后,NDEA生成量下降。當綠原酸濃度為2 mmol/L時，37 ℃保溫4 h檢測不到NDEA，80 ℃保溫1 h檢測的到。在一定濃度范圍內,0.1～0.8 mmol/L的綠原酸促進了亞硝胺的生成,而0.8～2 mmol/L的綠原酸抑制了亞硝胺的產生。作者前期研究表明,在模擬胃酸條件下,茶多酚和葡萄籽提取物具有抑制和促進亞硝胺生成的雙重作用效果,抑制程度與多酚物質的量有關[20]。多酚類物質和本研究的綠原酸都是含有多羥基的酚酸化合物,當其在低濃度時,酚酸與亞硝根離子結合形成醌類化合物,醌類不穩定,繼續結合亞硝根離子,形成亞硝-苯醌衍生物,可能促進了亞硝胺生成。但當酚酸達到一定量時,無過量的亞硝根離子與醌類物質反應,不能生成亞硝基苯醌衍生物,可能抑制了亞硝胺生成。

圖5 綠原酸對氧化蛋白體系中亞硝基二乙胺生成的影響Fig.5 Effect of Chlorogenic acid on the nitrosodiethylamine of MP after oxidation

2.6 亞硝胺與理化指標的相關性分析

相關理化指標與亞硝胺之間的相關性見表1。從表中可以看出,自由巰基與NDEA的生成顯著相關(p<0.05)。而理化指標之間,自由巰基與總巰基之間極顯著相關,疏水性與巰基(自由巰基和總巰基)極顯著相關(p<0.01),37 ℃ 4 h處理組和80 ℃ 1 h處理組之間極顯著相關(p<0.01)。孫衛青等采用相關性分析和主成分分析發現,豬肉蛋白的氧化程度與NDEA的生成量高度相關,羰基化合物促進了NDEA的生成[21]。

表1 羥自由基氧化體系中蛋白質理化指標與亞硝胺生成之間的相關性Table 1 Correlation between physicochemical changes and nitrosodiethylamine in MP oxidation in the absence of Chlorogenic acid

3 結論

羥自由基氧化導致肌原纖維蛋白羰基含量,內源色氨酸熒光強度降低,表明疏水性增強。添加綠原酸能在一定程度上抑制羰基含量的升高,但高濃度抑制效果不顯著。隨添加綠原酸濃度的增加,巰基含量和表明疏水性有升高趨勢,說明蛋白質結構進一步展開。低濃度的綠原酸促進了NDEA的生成,高濃度綠原酸抑制了NDEA的生成,具有劑量依賴性。可見,綠原酸對羥自由基引起的蛋白質氧化起到了一定的抑制作用。因此,通過向肉及肉制品中添加含有綠原酸的多酚類化合物,可防止蛋白質氧化,提高蛋白質的功能特性。

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