三重 PCR 快速檢測 H7N9 亞型流感病毒方法的建立

劉根梅，簡茗琪，高 天

（韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東 韶關 512005）

流感病毒可分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。A型流感病毒可從野生和家養的溫血動物（鳥和哺乳類）等廣泛分離到。2013年在我國華東地區出現的H7N9 亞型流感病毒（AIV），即為A型流感病毒，因其對公共衛生構成巨大威脅而受到廣泛關注。自2013年2月底在上海和安徽兩地率先發現并確診以來，我國已經歷5波流行。根據世界衛生組織的報告，截至2017年10月26日，人感染H7N9亞型AIV累計報告病例數1 564例；2013 年 3 月至 2017 年 6 月，全國 （不含香港、澳門、臺灣地區） 報告人感染 H7N9 亞型AIV共計1 445 例，死亡 562 例，病死率為 38.9%［1-2］。人感染的H7N9流感病毒是新亞型流感病毒，為全球首次發生［3-5］。Li 等［6］研究發現，82% 的患者有禽類接觸史，并且從患者體內分離出的H7N9 病毒與活禽市場中家禽分離出的病毒株之間的基因序列非常接近。Chen等［7］在活禽市場采集的家禽標本中分離到 H7N9 禽流感病毒，這些分離株與從患者身上分離到的病毒株高度同源。在新型H7N9 流感病毒的8 個基因片段中，H7 片段來源于浙江鴨群中分離的禽流感病毒，并可追溯至東亞地區野鳥中分離的相似病毒；N9 片段與東亞地區野鳥中分離的禽流感病毒同源；其余 6 個基因片段（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）則來源于 H9N2 禽流感病毒［8-9］。

在養禽業方面，雖然H7N9病毒弱毒株對家禽無致病性，但給我國養禽業（主要是雞）造成了巨大的經濟損失。2013 年以來，我國獸醫主管部門制定了嚴格的 H7N9 流感防控措施，但并沒有完全遏制 H7N9 病毒的擴散和傳播。目前已在多個省市的活禽交易市場和部分省市的養殖場分離到 H7N9 病毒［10］。更重要的是，H7N9 病毒已經發生基因突變，由原來對家禽無致病力病毒株變為高致病性病毒株［11］。因此，建立 H7N9 亞型流感病毒的快速檢測方法顯得十分必要。其中，分子生物學技術因其具有快速、敏感和特異等優點，已廣泛應用于 H7N9 流感病毒核酸檢測，是目前眾多學者研究的熱點之一。本研究建立了一種能同時鑒別 H7 亞型、N9 亞型的三重 PCR方法，并對該方法的特異性、敏感性和準確性進行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在韶關學院英東動物疫病實驗室完成。H7N9 亞型流感病毒模板、pMD-NA、pMDHA及pMD-M重組載體由中山大學惠贈，H1N1流感病毒模板、H9N2 流感病毒模板、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）由本實驗保存。

主要試劑：QIAamp Viral RNA Mini Kit ，購自 Qiagen 公司；PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit、Takara Taq? （with Mg2+free Buffer）、DL2000 DNA Marker，均購自 Takara 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 從 NCBI下載甲型流感病毒及H7N9 亞型流感病毒的多條基因序列，用DNAman 軟件對其進行同源性比較，確定H7亞型AIV HA基因、N9亞型AIV NA基因以及所有亞型AIV M基因的保守序列，設計出能檢測H7亞型AIV、N9亞型AIV以及所有亞型AIV的3對特異性引物，通過NCBI Blast驗證保證每對引物擴增出對應的病毒，不與其他病毒交叉。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物靶基因、引物名稱、引物序列和擴增片段大小如表1所示。

表1 引物序列信息

1.2.2 病毒RNA的提取 根據QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說明書抽提病毒RNA。利用 PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit，以RNA為模板進行反轉錄。反轉錄體系20 μL：50 μmol/L Random 6 mers 1 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 1 μL，5×PrimeScript II Buffer 4 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，200 U/μL PrimeScript II RTase 1 μL，模板 RNA 1 μg，RNase Free水補齊至 20 μL。

1.2.3 單重PCR 擴增 以cDNA為模板，用引物對H7-F/H7-R、N9-F/N9-R、M-F/M-R分別進行 PCR 擴增。反應體系50 μL：TaKaRa Taq（5 U/μL） 0.25 μL，10×PCR Buffer （Mg2+free）5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L） 4 μL，模板小于 500 ng，上下游引物濃度為0.2 μmol/L，滅菌水補齊至 50 μL。反應條件：預變性 94℃ 2 min；94℃ 30 s、50.2～60℃ 30 s、72℃ 45 s，30個循環；72℃延伸 10 min。其中最佳退火溫度由梯度PCR確定，退火溫度分別設置為50.2、51.5、52.6、54.0、57.2、59.2、60.0℃，PCR 產物經 2% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 三重PCR檢測方法的建立及優化 以cDNA為模板，用引物對H7-F/H7-R、N9-F/N9-R、M-F/M-R進行三重PCR擴增。分別對退火溫度、引物濃度、dNTP Mixture濃度和Mg2+濃度進行優化。

最適退火溫度的確立：分別以50.2、51.5、52.6、54.0、57.2、59.2、60.0℃的退火溫度進行梯度 PCR 反應，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳觀察，根據不同退火溫度下目的條帶的亮度確定最適退火溫度。

最適引物濃度的確立：設置上、下游引物終濃度分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μmol/L進行PCR 反應，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，確定最適引物濃度。

最適dNTP Mixture濃度的確立：設置dNTP Mixture濃度分別為 50、100、150、200、250、300、350 μmol/L進行PCR 反應，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，確定最適dNTP Mixture濃度。

最適Mg2+濃度的確立：設置Mg2+濃度分別為 0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25 mmol/L進行PCR 反應，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，確定最適Mg2+濃度。

1.2.5 三重PCR方法特異性試驗 以H1N1、H9N2、NDV、IBV等常見病毒cDNA為模板，利用優化的三重PCR 方法分別進行擴增，檢驗該方法的特異性。

1.2.6 三重PCR方法敏感性試驗 將pMDNA、pMD-HA及pMD-M重組質粒進行10倍梯度稀釋，并利用優化的三重PCR 方法進行擴增，檢驗其敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測 對韶關三鳥批發市場采集的470份咽肛拭子進行三重PCR檢測。每10個拭子合并為1個樣品，加入PBS緩沖液，提取RNA進行檢測。同時將備份的混樣樣品采用世紀元亨公司的禽流感病毒H7亞型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒進行檢測。

2 結果與分析

2.1 單重 PCR 擴增結果

提取H7N9 病毒RNA進行反轉錄，以cDNA為模板，用引物對H7-F/H7-R、N9-F/N9-R、M-F/M-R分別進行 PCR 擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳，分別獲得大小為304、160、458 bp的條帶，與預期片段大小相符。通過梯度PCR擴增，結果表明引物對H7-F/H7-R擴增基因時的最佳退火溫度為59.2℃，引物對N9-F/N9-R擴增基因時的最佳退火溫度為57.2℃，引物對M-F/M-R擴增基因時的最佳退火溫度為57.2℃。

2.2 三重PCR檢測方法的建立及優化

對三重PCR退火溫度、引物濃度、dNTP Mixture濃度和Mg2+濃度進行優化。其中通過溫度梯度PCR擴增，摸索最佳退火溫度，結果見圖1，退火溫度為59.2℃時，擴增條帶最為清晰，確定其為最佳退火溫度。通過PCR擴增，摸索H7-F/H7-R引物對、N9-F/N9-R引物對、M-F/M-R引物對的最佳引物濃度，結果見圖2，H7-F/H7-R引物對濃度為0.6 μmol/L時，擴增條帶最為清晰，確定其為最佳引物濃度；N9-F/N9-R引物對濃度為0.2 μmol/L時，擴增條帶最為清晰，確定其為最佳引物濃度；M-F/M-R引物對濃度為0.3 μmol/L時，擴增條帶最為清晰，確定其為最佳引物濃度。結合上述優化條件，設置dNTP Mixture濃度梯度，結果最佳dNTP Mixture濃度為250 μmol/L（圖3）；設置Mg2+濃度梯度，結果見圖4，在濃度為0.75 mmol/L 時幾乎沒有條帶，在 1.0 mmol/L 時開始出現條帶，在濃度大于1.25 mmol/L 條件下有相應3條條帶，為保證擴增效率，選擇最佳Mg2+濃度為1.50 mmol/L。三重PCR 最佳反應模式為：預變性 94℃ 2 min；94℃ 30 s、59.2℃ 30 s、72℃ 45 s，30個循環；72℃延伸 10 min。

圖1 三重PCR退火溫度梯度電泳結果

圖2 引物濃度梯度電泳結果

圖3 dNTP Mixture濃度梯度電泳結果

圖4 Mg2+濃度梯度電泳結果

2.3 三重PCR方法特異性試驗

利用所建立的三重PCR方法進行特異性試驗，分別對H7N9、H1N1、H9N2、IBV、NDV 進行檢測，結果見圖5，H7N9亞型流感病毒模板可擴增出3條特異性條帶，分別為304、160、458 bp，與預期相符，H1N1和H9N2亞型流感病毒模板則只擴增出458 bp的流感病毒通用條帶，而IBV、NDV均無任何擴增條帶出現，表明該方法具有良好的特異性。

圖5 特異性試驗電泳結果

2.4 三重PCR方法敏感性試驗

將pMD-NA、pMD-HA及pMD-M重組質粒進行10倍梯度稀釋，分別為6 ng～0.006 pg，利用所建立的三重PCR方法進行擴增，結果見圖6，重組質粒稀釋至0.6 pg時，可擴增出3條特異性條帶，而稀釋至0.06 pg以下時，則幾乎無擴增條帶出現，表明所建立的三重PCR方法最低能檢出0.6 pg的模板，說明該方法具有良好的敏感性。

圖6 敏感性試驗電泳結果

2.5 臨床樣品檢測

使用建立的三重PCR方法對市場采集的470份咽肛拭子進行檢測，結果顯示，沒有檢測出H7N9陽性樣品，但是其中有4份樣品擴增出458 bp的AIV通用條帶，表明這4份樣品感染了其他亞型的流感病毒。采用世紀元亨公司的禽流感病毒H7亞型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒進行檢測，也未檢出陽性，證實所建立的三重PCR檢測方法的準確性。

3 結論與討論

H7N9 亞型流感病毒是一種新型的流感病毒，能引起人感染死亡，給養禽業造成重大的經濟損失，對公共衛生安全構成重大威脅［3］。研究表明，H7N9 亞型流感病毒 HA發生了G186V 及 Q226L 關鍵氨基酸位點的變異，從而使得新型 H7N9 禽流感病毒更易與人上呼吸道SAα-2、6-Gal 受體結合，使其感染人的能力增強［12］。更重要的是，研究發現H7N9 病毒已經發生基因突變，由原來對家禽無致病力病毒株變為高致病性病毒毒株。因此，加強源頭控制，及時發現H7N9 亞型流感病毒則顯得尤為重要。而分子生物學技術因其具有快速、敏感和特異等優點，已廣泛應用于 H7N9 流感病毒核酸檢測，是目前眾多學者研究的熱點之一。其中實時熒光定量 RT-PCR檢測方法已大規模用于流感監測，實時RT-PCR檢測方法也是用于RNA病毒基因檢測最普遍的方法，也較為廣泛用于H7N9 流感病毒的核酸檢測［13-14］。多重 RT-PCR法因其具有多個特異性引物，在一個反應中可同時檢測多個病毒亞型，是一種經濟有效的檢測方法，因而得到廣泛應用［15-19］。

本研究針對 H7 亞型流感病毒的 HA 基因、N9 亞型流感病毒的 NA 基因和所有亞型流感病毒 M 基因的保守序列，分別設計了多對特異性引物，并通過實驗，將3對最佳特異性引物組合在一起，并分別對退火溫度、引物濃度、dNTP Mixture濃度和Mg2+濃度進行優化，建立了H7N9亞型流感病毒三重PCR檢測方法。該方法檢測可確定H7N9亞型流感病毒，也可鑒別H7亞型流感病毒、N9亞型流感病毒或其他亞型流感病毒。

本研究所建立的三重PCR方法，對于H7N9模板可擴增出3條特異性條帶，即304、160、458 bp，H1N1和H9N2模板可擴展出458bp的 AIV 通用條帶，而 IBV、NDV 均無任何擴增條帶出現，表明該方法具有良好的特異性。通過敏感性試驗，本方法最低能檢出 0.6 pg 的模板，證明該方法的敏感性較高。本研究建立的三重PCR方法，為快速鑒別和監測 H7N9 亞型流感病毒提供了技術手段，特別是對于尚不具備熒光定量 RT-PCR 檢測條件的實驗室，該方法是一種鑒別 H7N9 病毒的重要檢測方法。

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