樹(shù)干注藥對(duì)馬尾松針葉幾種生理指標(biāo)和保護(hù)酶活性的影響

楊鼎超，郝菲菲，張 揚(yáng)，張林平，欒豐剛，曾菊平

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院， 江西 南昌 330045）

樹(shù)干注藥技術(shù)是將藥劑直接注入樹(shù)干內(nèi)[1]，藥劑在樹(shù)體內(nèi)具有較長(zhǎng)的殘留期，相對(duì)于噴霧法和煙霧法，其對(duì)林木蛀干、枝梢等害蟲(chóng)有良好的防治效果，且不易污染環(huán)境、殺傷天敵等，因此，樹(shù)干注藥技術(shù)在林木害蟲(chóng)防治中得到極大應(yīng)用[2-4]。唐光輝等研究表明有內(nèi)吸性的藥劑在樹(shù)體內(nèi)的活性不如無(wú)內(nèi)吸作用的藥劑[5]。這表明注干藥劑不等同于內(nèi)吸性藥劑，藥劑的防效取決于助劑類型。然而，藥劑在樹(shù)體內(nèi)與植物密切接觸，會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生直接的影響[6]，故對(duì)樹(shù)干注藥開(kāi)展安全性研究具有重要意義。

氯氟氰蟲(chóng)酰胺是浙江省化工研究院有限公司自主開(kāi)發(fā)的一類高效、作用機(jī)制獨(dú)特的鄰苯二甲酰胺類新型殺蟲(chóng)劑[7]，與傳統(tǒng)的殺蟲(chóng)劑無(wú)交互抗性，對(duì)哺乳動(dòng)物較為安全，已廣泛用于鱗翅目害蟲(chóng)的防治[8-11]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)氯氟氰蟲(chóng)酰胺在林木中輸導(dǎo)及其安全性評(píng)價(jià)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，而氯氟氰蟲(chóng)酰胺在林間對(duì)松材線蟲(chóng)病Bursaphelenchus xylophilus表現(xiàn)出良好的防效[12]。為此，采用樹(shù)干注藥技術(shù)將氯氟氰蟲(chóng)酰胺液體制劑注入馬尾松Pinus massoniana樹(shù)干內(nèi)，分析其對(duì)馬尾松針葉葉綠素含量、可溶性糖含量、丙二醛、苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶的影響，探索其對(duì)馬尾松生理代謝的作用機(jī)制，為樹(shù)干注藥技術(shù)對(duì)馬尾松的安全性評(píng)價(jià)和松材線蟲(chóng)病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

4.8 %氯氟氰蟲(chóng)酰胺乳油，4.5%甲維鹽乳油由江西大農(nóng)化工有限公司提供，分別裝至50 mL容量注射瓶?jī)?nèi)。丙酮、丙二醛試劑盒、超氧岐化酶試劑盒、苯丙氨酸解氨酶試劑盒、蒽酮、乙酸乙酯等藥劑和試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

供試樹(shù)木馬尾松，于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)南昌商學(xué)院校園內(nèi)選擇樹(shù)齡8 a，樹(shù)高5 ～ 6 m，胸徑8 cm左右，生長(zhǎng)良好的馬尾松45棵。

1.2 樹(shù)干注藥及采樣

于2015年3月25日采用注干施藥技術(shù)，用便攜式電鉆傾斜45°在馬尾松樹(shù)干距地面1.3 m處打1個(gè)4 ～ 5 cm深的孔，每棵樹(shù)分別注入4.8%氯氟氰蟲(chóng)酰胺乳油或4.5%甲維鹽乳油1瓶（50 mL），每個(gè)處理重復(fù)3次（每個(gè)重復(fù)5株，即2種藥劑各注15棵），以不注藥的等量馬尾松為對(duì)照（CK）。在注藥后的1 d，4 d，8 d，12 d，16 d分別在處理樹(shù)冠中部的東、西、南、北四個(gè)方向進(jìn)行針葉取樣，每個(gè)方向每次取樣量不少于30 g，將針葉用自來(lái)水沖洗干凈擦干后，密封于真空封口袋中，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

將待測(cè)的馬尾松針葉于105℃下殺青，80℃下烘干，稱重后研磨粉碎。葉綠素含量的測(cè)定采用丙酮法進(jìn)行，具體方法參考張憲政[13]，并略有改動(dòng)。可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法進(jìn)行，具體方法參考李合生等[14]，并略有改動(dòng)；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定[15]。

1.4 保護(hù)酶活性測(cè)定

酶粗提液的制備具體方法參照唐光輝等[16]，并稍作改動(dòng)。苯丙氨酸解氨酶（PAL）通過(guò)測(cè)定D290值，以D290變化0.01為1個(gè)酶活力單位[17]；超氧化物歧化酶（SOD）采用黃氮藍(lán)四唑法（NBT）測(cè)定[14]，每分鐘內(nèi)抑制光氧化還原NBT 50%為1個(gè)酶活性單位（U），酶活性為每克鮮樣的U數(shù)（U·g-1）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件，Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析，作圖采用Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹(shù)干注藥對(duì)馬尾松針葉葉綠素的影響

由圖1可知，處理4 d時(shí)2種藥劑均可導(dǎo)致總?cè)~綠素，葉綠素a，b含量下降，其中氯氟氰蟲(chóng)酰胺處理葉綠素a含量降低最多（10.3%），但處理8 d后2種藥劑又可引起總?cè)~綠素，葉綠素a，b含量呈不同程度升高，仍以氯氟氰蟲(chóng)酰胺的刺激作用較為顯著，16 d時(shí)葉綠素a含量較對(duì)照提高了10.5%。因此，樹(shù)干注藥對(duì)馬尾松針葉內(nèi)總?cè)~綠素含量沒(méi)有顯著影響，但對(duì)葉綠素a含量有顯著影響（表1）。

圖1 樹(shù)干注藥對(duì)馬尾松針葉葉綠素含量的影響Figure 1 Trunk injection of 2 pesticides on the chlorophyll content in leaves of P. massoniana

表1 樹(shù)干注藥后馬尾松針葉葉綠素方差分析Table 1 ANOVA on chlorophyll content in leaves of P. massoniana after trunk injection

2.2 樹(shù)干注藥對(duì)可溶性總糖含量的影響

由圖2可知，2種藥劑處理對(duì)馬尾松針葉中可溶性總糖含量有不同程度的影響。氯氟氰蟲(chóng)酰胺處理8 d時(shí)可溶性總糖含量最低，比對(duì)照降低15%，12 d達(dá)到最高；甲維鹽注藥4 d時(shí)可溶性總糖含量最高，12 d時(shí)可溶性總糖含量最低，比對(duì)照降低35%。由方差分析可知，不同藥劑樹(shù)干注射對(duì)馬尾松針葉內(nèi)總可溶性糖含量沒(méi)有顯著影響（表2）。

表2 樹(shù)干注藥后馬尾松針葉可溶性糖方差分析Table 2 ANOVA on soluble sugar content in leaves of P. massoniana after trunk injection

圖2 樹(shù)干注藥對(duì)針葉中可溶性總糖含量的影響Figure 2 Effect trunk injection of pesticides on total soluble sugar content of in leaves of P. massoniana

圖3 樹(shù)干注藥后馬尾松針葉內(nèi)MDA含量的變化Figure 3 Effect trunk injection of pesticides on MDA content in leaves of P. massoniana

2.3 樹(shù)干注藥對(duì)馬尾松針葉中MDA含量的影響

由圖3可知，樹(shù)干注藥后MDA含量經(jīng)歷上升-下降的變化。2種藥劑處理4 d時(shí)，MDA含量均達(dá)到最高，與對(duì)照相比均上升了42%；藥后16 d時(shí)各藥劑處理組的MDA含量均已接近對(duì)照水平。由表3可知，不同藥劑樹(shù)干注射對(duì)馬尾松針葉內(nèi)MDA含量有顯著影響。

表3 樹(shù)干注藥后馬尾松針葉丙二醛方差分析Table 3 Variance analysis of MDA content of P. massoniana by trunk injection

2.4 樹(shù)干注藥對(duì)馬尾松針葉內(nèi)SOD活性的影響

由表4可知，不同藥劑樹(shù)干注射對(duì)馬尾松針葉內(nèi)SOD酶活性有顯著影響。由圖4可知，樹(shù)干注藥后SOD活性呈上升-下降-上升-下降的波動(dòng)變化。氯氟氰蟲(chóng)酰胺處理對(duì)SOD活性影響較顯著，注藥后4 d酶活性達(dá)到最高，與對(duì)照相比上升了39.5%；而甲維鹽處理4 d后酶活性也達(dá)到最高，與對(duì)照相比上升了31.7%，而處理8 d時(shí)酶活性達(dá)到最低。藥后16 d 2種藥劑處理SOD活性均逐漸接近對(duì)照水平。

表4 樹(shù)干注藥后馬尾松針葉SOD酶活性方差分析Table 4 ANOVA on SOD avtivity in leaves of P. massoniana after trunk injection

圖4 樹(shù)干注藥后馬尾松針葉內(nèi)SOD酶活性的變化Figure 4 Effect of trunk injection of pesticides on SOD activity in leaves of P. massoniana

圖5 樹(shù)干注藥后馬尾松針葉內(nèi)PAL酶活性的變化Figure 5 Effect of trunk injection of pesticides on PAL activity in leaves of P. massoniana

2.5 樹(shù)干注藥對(duì)馬尾松針葉中苯丙氨酸解氨酶PAL活性的影響

樹(shù)干注藥后PAL活性經(jīng)歷上升-下降的變化，且氯氟氰蟲(chóng)酰胺對(duì)PAL酶活性影響顯著（圖5，表5）。2種藥劑處理8 d后酶活性達(dá)到最高，其中氯氟氰蟲(chóng)酰胺處理與對(duì)照相比，酶活性上升了40.7%，之后迅速下降；而甲維鹽處理后8 d，與對(duì)照相比酶活性上升了22.8%，隨后緩慢下降。

表5 樹(shù)干注藥后馬尾松針葉PAL酶活性方差分析Table 5 ANOVA on PAL activity in leaves of P. massoniana after trunk injection

3 結(jié)論與討論

2種注干藥劑經(jīng)樹(shù)干注射后對(duì)馬尾松針葉內(nèi)葉綠素、可溶性總糖、MDA含量和SOD、PAL酶活性均可產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而可能會(huì)對(duì)馬尾松的正常生理代謝產(chǎn)生一定的影響。2種注干藥劑對(duì)葉綠素、可溶性總糖含量的影響主要表現(xiàn)為先抑制后增高，而對(duì)MDA含量的影響主要表現(xiàn)為先增高后降低。藥劑處理后SOD、PAL活性均呈現(xiàn)出先上升、后抑制的波動(dòng)變化，其中藥劑氯氟氰蟲(chóng)酰胺對(duì)SOD、PAL活性影響較為明顯。

農(nóng)藥使用后對(duì)非靶標(biāo)植物生長(zhǎng)[18]和生理代謝的影響日益受到研究人員的關(guān)注，垂柳Salix babylonicaLinn.樹(shù)干注藥后，導(dǎo)致其葉片葉綠素和可溶性蛋白含量下降，垂柳的正常生理代謝受到抑制[19]；桃Amygdalus persicaL.采用樹(shù)干注藥和葉面噴霧 2種施藥方法，結(jié)果葉面噴霧造成葉綠素含量下降、凈光合速率降低，而樹(shù)干注藥則增加葉綠素含量并提高凈光合速率[20]，上述研究結(jié)果表明，農(nóng)藥可以抑制植物的生長(zhǎng)和代謝。本研究結(jié)果表明，氯氟氰蟲(chóng)酰胺和甲維鹽樹(shù)干注藥后可在短期內(nèi)使馬尾松針葉葉綠素、可溶性糖含量降低，表明該2種藥劑對(duì)葉綠素、可溶性糖含量具有抑制作用，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，針葉抵制藥劑富集作用后逐漸適應(yīng)，葉綠素、可溶性糖含量又可恢復(fù)至對(duì)照水平，而 MDA含量先增加后減少，表明樹(shù)干注藥后馬尾松的防御系統(tǒng)首先產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，生產(chǎn)大量MDA，隨著時(shí)間的推移，藥劑對(duì)馬尾松的脅迫逐漸減弱，馬尾松樹(shù)體可通過(guò)自身的調(diào)節(jié)作用恢復(fù)正常的生理生化代謝水平。同時(shí)，氯氟氰蟲(chóng)酰胺樹(shù)干注射不同程度地提高馬尾松針葉內(nèi)SOD，PAL的活性，這與唐光輝等[16]研究結(jié)果相一致。此外，脯氨酸（與細(xì)胞壁的形成有關(guān)）含量變化和其他生理指標(biāo)測(cè)定在后續(xù)的試驗(yàn)中進(jìn)行完善，同時(shí)將測(cè)定氯氟氰蟲(chóng)酰胺注干后土壤相關(guān)酶變化等，以便更好評(píng)價(jià)氯氟氰蟲(chóng)酰胺注干后對(duì)馬尾松生長(zhǎng)和代謝的影響。

樹(shù)干注藥的藥劑使用不當(dāng)會(huì)對(duì)樹(shù)體產(chǎn)生藥害，周家華等[21]進(jìn)行柑橘Citrus reticulataBlanco保果試驗(yàn)時(shí)，大劑量使用“噴施靈”增加了柑橘的落果量；陳運(yùn)全等[22]使用高濃度營(yíng)養(yǎng)液注射柑橘枝干后導(dǎo)致受害枝葉全部脫落。本試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，用30 mL氯氟氰蟲(chóng)酰胺和甲維鹽液體制劑注射3 ～ 4年生馬尾松苗時(shí)，導(dǎo)致部分松苗死亡，而注射5年生以上馬尾松苗時(shí)，則未出現(xiàn)松苗死亡現(xiàn)象，表明藥劑不論注干還是葉面噴施時(shí)使用劑量要適量。有關(guān)氯氟氰蟲(chóng)酰胺樹(shù)干注射的有效劑量，藥劑在馬尾松樹(shù)體內(nèi)的殘留時(shí)間以及馬尾松樹(shù)體應(yīng)對(duì)氯氟氰蟲(chóng)酰胺脅迫和自我調(diào)節(jié)恢復(fù)機(jī)制，有待于進(jìn)一步深入研究。

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