樟子松2種塊菌屬外生菌根形態描述和分子鑒定

張文泉，羅國濤，閆 偉

（1. 凱里學院，貴州 凱里，556011；2. 內蒙古農業大學 林學院，內蒙古 呼和浩特 010019）

塊菌（Truffles）是一類地下真菌，其許多種類具有極高的經濟價值，是大型真菌中最為珍稀名貴的食用真菌之一，含有豐富的營養物質及多種易被人體吸收的氨基酸和無機鹽，如黑孢塊菌Tuber melanosporum和意大利白塊菌T. magnatum，與魚子醬、鵝肝醬同被稱為三大珍品。國外對塊菌的研究有近200 a歷史，1985我國的劉波首次對太原塊菌T. taiyuanense進行報道[1]。有人對我國的塊菌資源開展了大量的研究。至今已報道的中國塊菌有近30種，主要分布于我國的國塊菌主要分布在四川和云南，此外西藏、新疆、山西、遼寧、吉林、福建、湖南、湖北、甘肅、北京、河北、臺灣均有分布，主要集中在100° ～ 105° E，25° ～ 30° N這一條帶上[2-4]。

樟子松Pinus sylvestrisvar.mongolica適應性強，抗寒、抗旱、耐貧瘠，防風固沙作用顯著，在我國北方地區廣泛分布。由于樟子松適應性強而且較速生，目前是我國北方地區主要的造林樹種之一[5-6]。對內蒙古樟子松外生菌根真菌多樣性的調查中發現[7-8]，與樟子松共生的外生菌根真菌中有典型的Tuber屬真菌2種塊菌，對其類型進行了描述和分子鑒定，為樟子松優良鄉土菌種篩選提供理論基礎，同時又豐富了我國北方地區塊菌菌根真菌資源多樣性。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

采集地點為內蒙古自治區呼倫貝爾大興安嶺林場莫爾道嘎林業站及紅花爾基林業站、烏蘭察布市涼城林場、赤峰市黃崗梁林場、鄂爾多斯市伊金霍洛旗林場、遼寧章古臺林場，每個林場作為一個采集地。在以上采集地的樟子松天然林或人工純林群落中距樟子松主干0.5 ～ 1.0 m范圍內，取長×寬×深為20 cm×20 cm×30 cm 帶根土樣，每一采集地隨機采集9個樣品，每一樣品的采集地間隔10 m以上，采集時間分別為2014，2015年的5月與10月，每個采集地都采樣2次遼東塊菌。所采集的樣品分別采用密封塑料袋分裝，樣品取回后與密封塑料袋一起置于4℃冰箱內保存。

1.2 樣品處理

樣品取回后盡早取樣，最遲5 d內處理完畢，將土樣浸泡于水中2 ～ 3 h后倒入土篩中流水沖洗，將洗凈后的根樣剪成小段，置于培養皿中，采用體視顯微鏡觀察，挑選出有菌根的根段。

1. 3 形態分類

根據菌根表面特征對菌根進行初步分類，分類的依據為顏色、外延菌絲、有無根狀菌索、菌核、囊狀體等特征，并采用Olympus SZX10體視顯微鏡拍照，記錄其顯著特征。

對初步分類后的每一菌根類別的菌套進行剝離、制片。在Olympus BX41光學顯微鏡下對每一菌根類別的菌套特征、外延菌絲特征、菌索特征進行觀察并詳細記錄。

結合菌根的外部形態特征和菌套的解剖結構特征，將菌根分成不同的形態類型，將每一種形態類型的菌根選取新鮮、幼嫩、純凈的同一分支系統菌根一部分采用1/2 FAA固定液，用于形態觀察，另一部分置于CTAB緩沖液中保存，用于分子生物學鑒定。菌根系統形態分類和描述參照Agerer[9-10]。

1.4 分子鑒定

1.4.1 DNA的提取 采用 CTAB法[7]提取DNA。

1.4.2 PCR擴增 PCR反應體系（50 u1）中：Template 2 ul；ITS1s，ITS4引物各2 ul，2×Master Mixture 25 ul，不足部分用ddH2O補足，PCR擴增反應在Eppendorf Masetercycler PCR儀上進行，擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，56℃退火60 s，72℃延伸60 s，35個循環，72℃平展10 min，PCR產物的純化和測序交由生工生物工程公司。序列的編輯用Bioedit完成。在GenBank（NCBI）將編輯的菌根rDNA ITS序列進行比對分析，根據序列的相似度來確定菌根真菌的分類關系。

2 結果與分析

2.1 形態和解剖結構特征

通過外生菌根的形態比較觀察，發現樟子松的外生菌根中有2個類型的形態結構與塊菌屬相似，對這2個塊菌屬的樟子松外生菌根形態和解剖結構特征描述如下。

類型1。

菌根系統為單軸或羽狀分支，分支1 ～ 2級，親水。未分支的末端細尖狀，末端未見明顯膨大，長1 ～ 2 mm，直徑0.7 mm，幼時為淺褐色，老時顏色略有加深，為黃褐色。未分支末端有少量稀疏的外延菌絲，外延菌絲較短，無根狀菌索，無囊狀體，無菌核（圖1A，圖1B）。

外層菌套為擬薄壁組織，菌套類型為M型[9-10]，菌絲細胞的細胞壁較薄，菌絲有隔，無鎖狀聯合，菌絲互相連接呈表皮細胞狀，菌絲表面較光滑，彎曲分支形成網狀。內層菌套與外層菌套一致（圖1C，圖1D）。菌套7 ～ 8 μm厚，由橢圓形細胞規則排列組成，哈蒂氏網伸入皮層細胞2 ～ 3層（圖1E，圖1F）。

圖1 類型1菌根外部形態和解剖結構圖Figure 1 External morphology and anatomical features of type 1

圖2 類型2菌根外部形態和解剖結構圖Figure 2 External morphology and anatomical features of type 2

類型2。

菌根系統為二叉分支，分支1 ～ 2級，親水。菌根的末端圓棒狀，末端可見明顯膨大，長1.0 ～ 1.5 mm，直徑為1 mm，幼嫩時為淺黃色，老時為黃白色，由菌根基部至頂端顏色逐漸變淡，菌根頂端透明，發亮。菌根末端有少量絨毛狀的外延菌絲，外延菌絲稀疏，較細，無根狀菌索，無囊狀體，無菌核（圖2A，圖2B）。

外層菌套為擬薄壁組織，菌套類型為Q型，菌絲細胞無規則膨大，排列整齊，緊密，菌絲細胞的細胞質均勻，細胞壁較薄，彎曲后相互纏繞形成網紋狀，內層菌套為密絲組織，菌套類型為E型，菌絲細胞細胞壁薄，菌絲分支較多，且膨大，卷曲盤繞，比外層菌套的菌絲纏繞更緊密，形成網眼狀（圖2C，圖2D）。平面觀哈蒂氏網呈網狀，菌絲有隔，無鎖狀聯合，菌絲細胞呈圓形，哈蒂氏網深入到整個外皮層細胞，達內皮層細胞的外層（圖2E）。

2.2 分子鑒定

將類型1，類型2所測的DNA序列在NCBI中進行比對，在可比較的堿基范圍內進行DNA序列同源性比較時，自動濾除了低復雜性序列（Low-complexity sequence）和未命名的序列，BLAST查詢的結果表明：類型1與編號為gi|323903052|gb| GU979037.1|的遼東塊菌T. liaotongenseITS區段DNA序列同源性為500/504（99%），兩者相比較的score值為905 bits，空位值Gaps=3/504（1%），E值為0.0。因此確定類型1為此種。

類型2與編號為gi|315666394|gb| HM485403.1|的卡斯蒂利亞塊菌T. castilloiITS區段DNA序列同源性為518/553（94%）。兩者相比較的score值為815 bits，空位值Gaps=14/553（0%），E值為0.0。BLAST查詢結果中列出的100個E值為0.0的主要同源序列中所有都屬于Tuber屬，所以可確定類型2為塊菌屬的一個種。

3 結論與討論

從菌根的外部形態觀察得知：類型1與類型2兩個類型菌根的顏色均比較淺，其中類型2菌根頂端呈透明狀；菌根系統的分支不多，均只是在菌根表面有少量的外延菌絲而且比較稀疏。從解剖結構上可知：類型1與類型2兩個類型菌根的外層菌套均為擬薄壁組織，菌絲細胞的細胞壁較薄，兩個類型的菌絲均有隔，無鎖狀聯合，內外層菌套的菌絲均出現不同程度的彎曲，形成網紋狀。類型1與類型2在形態和解剖結構特征上與之前在白樺Betula platyphylla上發現的菌根Tuberaceaesp[11]十分相似，具有塊菌屬外生菌根區別于其他屬外生菌根的典型外部形態特征及解剖結構特點，初步可確定為塊菌屬的外生菌根。

進一步進行分子鑒定可知：類型1，類型2均為塊菌屬的外生菌根真菌，類型1可鑒定到種，為遼東塊菌。

目前，對塊菌的研究主要集中在系統分類學、生態學、生物化學及人工栽培等方面，因塊菌屬子囊果生于地下，采集困難，大多數種類的地理分布尚不明確，該屬大多數種類的遺傳多樣性研究還存在一定的困難，此方面的研究鮮見報道[12-16]。本文通過分子鑒定后對與樟子松共生的2種塊菌類型外生菌根的外部形態及解剖結構進行了描述，既擴大了樟子松外生菌根類型的多樣性，為樟子松優良鄉土菌種篩選提供理論基礎，又為塊菌屬外生菌根的鑒定及塊菌屬種類的遺傳多樣性分析提供依據，并豐富了我國北方地區塊菌菌根真菌資源多樣性。

塊菌屬分類鑒定大多是依據其子囊果的形態特征進行區分，但許多形態相似的或相近的種的區分成為難題，能否通過其所形成的外生菌根的特征及提取 DNA依靠分子生物學等現代研究手段來尋找更多更可靠的分類證據？新近的報道指出：我國的塊菌屬資源豐富，而且獨特，尚存在著大量的新分類群未被發現[17-19]，諸多已知的種類通過研究與比對雖與歐洲及北美地區的某些種類極其相似，但其分布范圍卻不盡相同，如：樊永軍等[20]人在賀蘭山發現冬塊菌Tuber brumale在內蒙古地區的新記錄種。因此，針對我國塊菌屬系統完整的分類描述及大量的資源調查工作還有待進一步加強。

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