呼出氣冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21檢測對(duì)孤立性肺結(jié)節(jié)早期肺癌的診斷價(jià)值及臨床相關(guān)性研究

羅家友 周凌燕 張麗娟 華鋒 馬志紅 沈綺斌 王斌 崔恩海

[摘要] 目的 探討呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、P53蛋白、miRNA21在肺癌組患者中的診斷價(jià)值及臨床相關(guān)性。 方法 隨機(jī)選擇2014年12月～2017年6月入住我院呼吸科的胸外科孤立性肺結(jié)節(jié)需手術(shù)切除患者51例，根據(jù)術(shù)后病理將孤立性肺結(jié)節(jié)患者分為肺癌組35例、非肺癌組16例，同期體檢者12例為對(duì)照組。所有患者均采集呼出氣冷凝液、空腹靜脈血。采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定CEA水平、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定P53蛋白水平、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR法）測定miRNA21水平，分析呼出氣冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21對(duì)孤立性肺結(jié)節(jié)早期肺癌的診斷價(jià)值。 結(jié)果 肺癌組EBC的CEA、P53蛋白、miRNA21表達(dá)水平均高于非肺癌組與對(duì)照組（P<0.05）；肺癌組患者EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表達(dá)水平與性別、年齡、TNM、病理類型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；聯(lián)合檢測EBC的CEA、P53蛋白、miRNA21對(duì)孤立性肺結(jié)節(jié)早期肺癌的診斷敏感性、特異性均優(yōu)于單項(xiàng)檢測（AUC 0，931 P<0.05）。 結(jié)論 聯(lián)合檢測呼出氣冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21有助于孤立性肺結(jié)節(jié)早期肺癌的篩查，提高診斷的敏感性和特異性。

[關(guān)鍵詞] 呼出氣冷凝液；癌胚抗原；P53蛋白；miRNA21；孤立性肺結(jié)節(jié)；早期肺癌、診斷價(jià)值；相關(guān)性

[中圖分類號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）07-0005-04

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic value and clinical correlation of exhaled breath condensate（EBC） carcinoembryonic antigen（CEA）， P53 protein and miRNA21 in lung cancer patients. Methods 51 patients with solitary pulmonary nodules in need of surgical incision who were admitted to the department of respiratory medicine and the department of thoracic surgery in our hospital from December 2014 to June 2017 were randomly selected. According to the postoperative pathology， the patients with solitary pulmonary nodules were divided into lung cancer group（n=35）， non-lung cancer group（n=16）. In the same period， 12 cases receiving physical examination were selected as the control group. Exhaled breath condensate and fasting venous blood were collected in all patients. The CEA level was measured by using the automatic chemiluminescence immunoassay analyzer. The level of P53 protein was determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and the level of miRNA21 was tested by real-time fluorescence quantitative PCR（RT-PCR）. The diagnostic value of exhaled breath condensate CEA， P53 protein and miRNA21 in solitary pulmonary nodules in early stage of lung cancer was analyzed. Results The levels of CEA， P53 protein and miRNA21 expression of EBC in lung cancer group were significantly higher than those in non-lung cancer group and control group（P<0.05）； the levels of CEA， P53 protein and miRNA21 expression of EBC in lung cancer group were not statistically significantly different from those in gender， age， TNM and pathological types（P>0.05）； the diagnostic sensitivity and specificity of combined detection of CEA， P53 protein and miRNA21 of EBC in solitary pulmonary nodules in the early stage of lung cancer were better than single detection（AUC 0.931， P<0.05）. Conclusion Combined detection of CEA， P53 protein and miRNA21 of EBC is helpful for the screening of solitary pulmonary nodules in the early stage of lung cancer and improve the sensitivity and specificity of diagnosis.

[Key words] Exhaled breath condensate； Carcinoembryonic antigen（CEA）； P53 protein； miRNA21； Solitary pulmonary nodules； Early lung cancer； Diagnostic value； Correlation

肺癌是最常見的惡性腫瘤，是發(fā)病率第一、最致命的惡性腫瘤之一，中國的肺癌占全球1/3以上[1，2]，由于起病隱匿，早期缺乏典型臨床癥狀，70.0%以上患者確診時(shí)已經(jīng)是中、晚期，喪失手術(shù)根除機(jī)會(huì)，嚴(yán)重影響人民健康[3]，因此對(duì)早期肺癌的篩查成為呼吸科研究的熱點(diǎn)。本課題隨機(jī)選擇2014年12月～2017年6月入住我院呼吸科、胸外科的需手術(shù)切除的孤立性肺結(jié)節(jié)肺癌患者51例作為研究對(duì)象，探討呼出氣冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21對(duì)早期肺癌的篩查價(jià)值及臨床相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選擇2014年12月～2017年6月入住我院呼吸科、胸外科的孤立性肺結(jié)節(jié)需手術(shù)切除患者51例，根據(jù)術(shù)后病理分為肺癌組和非肺癌組。肺癌組男23例，女12例，年齡42～75歲，平均（63.27±7.92）歲，病灶直徑0.8～3.0 cm；病理類型：鱗癌5例，腺癌30例；TNM分期：Ⅰa期18例、Ⅰb期11例、Ⅰc期6例。非肺癌組16例，男10例，女6例，年齡40～76歲，平均（64.09±7.97）歲，病灶直徑0.9～2.9 cm。選擇同期健康體檢者12例作為對(duì)照組，男7例，女5例，年齡50～57歲，平均（53.50±4.31）歲。本課題得到醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，患者及家屬對(duì)治療方案具備知情權(quán)。三組的性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合孤立性肺結(jié)節(jié)肺癌、孤立性肺結(jié)節(jié)非肺癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)者[7]；（2）最終均經(jīng)過影像學(xué)檢查、手術(shù)病理或組織學(xué)檢查得到確診；（3）能遵循醫(yī)囑完成相關(guān)檢查及診斷者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）肺內(nèi)多發(fā)結(jié)節(jié)或最大直徑大于3.0 cm腫塊；（2）合并其他惡性腫瘤及全身免疫性疾病者；（3）嚴(yán)重心肺疾病不能耐受呼出氣冷凝液檢查。

1.3 方法

13.1 EBC采集 EBC收集采用EricJaeger Company生產(chǎn)的EcoScreen冷凝器采集，所有研究對(duì)象要求禁食禁煙12 h，于晨起空腹時(shí)進(jìn)行EBC采集，在EBC收集之前半小時(shí)，不做用力肺活量、時(shí)間肺活量、最大通氣量檢查。受試者漱口清潔口腔，在25℃的室溫環(huán)境下進(jìn)行平靜呼吸，戴鼻夾通過單向活瓣平靜呼吸，呼出氣在收集器-5℃低溫收集管中可冷凝變?yōu)橐籂钗铮〕鍪占埽瑢⑹占?～4 mL的EBC裝入無菌標(biāo)本管內(nèi)，然后立即置于-70℃低溫冰箱內(nèi)保存。收集過程中若有唾液或痰液隨時(shí)將其吐出，以避免影響檢測結(jié)果。對(duì)所有收集的EBC檢測唾液淀粉酶排除唾液的污染，若唾液淀粉酶檢測陽性需次日重新采集并達(dá)到要求。

1.3.2 血清采集 采集51例孤立性肺結(jié)節(jié)患者、12例健康體檢者的外周靜脈血5 mL，10 min離心，速度為5000 rpm，仔細(xì)抽取上層血清，將其放置在-70℃冰箱中保存。

1.3.3 檢測方法 采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定CEA水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定三組P53蛋白水平，有關(guān)操作嚴(yán)格遵循試劑盒、儀器說明書完成；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR法）測定三組miRNA21水平。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI公司生產(chǎn)提供）完成miRNA的反轉(zhuǎn)錄，保證反轉(zhuǎn)錄整個(gè)體系為15 μL，通過查閱Sanger micro-RNA序列獲得miRNA21相應(yīng)的序列引物，根據(jù)每一位標(biāo)本情況設(shè)置反轉(zhuǎn)錄條件：16℃下30 min，42℃下30 min，85℃下5 min，最后在4℃下保持恒溫，將獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用RT-PCR系統(tǒng)完成定量檢測，保證整個(gè)反應(yīng)體系為20 μL，設(shè)置PCR檢測反應(yīng)條件：95℃下10 min，95℃下15 s，60℃下1 min，連續(xù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。最后通過PCR自帶軟件獲得基線與閾值后，將miR16作為內(nèi)參，讀取相應(yīng)miR16、miR21循環(huán)閾值，計(jì)算兩種循環(huán)閾值，采用兩種循環(huán)閾值表示miRNA21表達(dá)水平[8，9]。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）觀察肺癌組與非肺癌組及對(duì)照組呼出氣冷凝液、空腹靜脈血中CEA、P53蛋白、miRNA21表達(dá)水平情況。（2）觀察肺癌組各亞組EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表達(dá)水平差異性；（3）評(píng)估聯(lián)合與單一檢測EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21在早期肺癌的診斷敏感性、特異性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，采用[n（%）]表示，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，對(duì)EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21診斷效能繪制ROC曲線，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較獲得敏感性、特異性參數(shù)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組CEA、P53蛋白、miRNA21表達(dá)水平比較

肺癌組EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表達(dá)水平均高于非肺癌組與對(duì)照組（P<0.05），但血清檢測結(jié)果與非肺癌組和對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；非肺癌組與對(duì)照組EBC及血清中CEA、P53蛋白、miRNA21表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 肺癌組臨床特征與EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21相關(guān)性

肺癌組患者EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表達(dá)水平與性別、年齡、TNM分期、病理類型無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表2。

2.3 肺癌組EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21診斷效能

單項(xiàng)檢測CEA、miRNA21對(duì)早期肺癌診斷敏感性和特異性較P53蛋白高（P>0.05）；聯(lián)合檢測CEA、P53蛋白、miRNA21診斷肺癌的敏感性、特異性高于單一檢測（AUC 0.931，P<0.05）。見表4、封三圖1。

3 討論

肺癌是臨床上常見的疾病，具有發(fā)病率高、死亡率高、治愈率低等特點(diǎn)，隨著我國工業(yè)化程度的進(jìn)程、空氣霧霾的加劇，肺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響我國居民健康[4]。孤立性肺結(jié)節(jié)（pulmonary nodule）是指邊界清楚、影像學(xué)不透明并且直徑≤3 cm，周圍完全被含氣肺組織包繞的肺部結(jié)節(jié)[5-6]。多數(shù)肺癌患者[7-8]發(fā)病早期以孤立性結(jié)節(jié)為主要表現(xiàn)，肺癌、淋巴瘤、肺轉(zhuǎn)移性腫瘤、肉芽腫、特異性肉芽腫感染均可表現(xiàn)為肺結(jié)節(jié)，盡管高分辨CT能為我們提供較多的影像學(xué)信息，但仍有較高的誤診率[9-10]。呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）檢測方法是一種新的無創(chuàng)收集下呼吸道揮發(fā)性及非揮發(fā)性物質(zhì)的方法，具有無創(chuàng)傷、收集簡單、患者易接受、可反復(fù)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)。大量研究表明，在確診非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的EBC中能檢查多種腫瘤指標(biāo)，且具有較高的敏感性、特異性，可能成為肺癌早期診斷、篩查腫瘤高危人群的一種新途徑[11-12]。

CEA是一種富含多糖的蛋白復(fù)合物。對(duì)腫瘤的診斷、預(yù)后、復(fù)發(fā)判斷有意義，是檢測腫瘤的首選標(biāo)志物之一。miRNA與腫瘤密切相關(guān)，在人類基因組中已鑒定的1000多個(gè)miRNA中，2002年Calin GA等[6]首次揭示了miRNA的異常調(diào)控與腫瘤的相關(guān)性。由于miRNA與眾多腫瘤相關(guān)，故外周血檢測結(jié)果很難確定與肺癌相關(guān)性，EBC來自于肺部，其中所含的微量miRNA主要來自于肺部，故對(duì)EBC中miRNA的檢測有助于肺癌的診斷，有研究顯示[13-15]，miRNA21在NSCLC的血和EBC中高表達(dá)。本研究顯示，孤立性肺結(jié)節(jié)肺癌組EBC中CEA濃度、miRNA21與非肺癌組及對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)差異，與肺癌的分期及病理類型無相關(guān)性，對(duì)肺癌診斷的敏感性及特異性均較高（AUC：0.875、0.892，P<0.05），是篩查早期肺癌的較為敏感指標(biāo)[16-17]。P53蛋白是一種由-53抑癌基因編碼的蛋白，能直接參與機(jī)體細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA的修復(fù)與合成。P53基因發(fā)生突變后將會(huì)造成癌變、突變型P53蛋白呈高表達(dá)[18]。本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌患者EBC中p53蛋白的濃度明顯高于非肺癌組及對(duì)照組，與肺癌的分期、病理類型及分化程度無差異，與有些文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道相符，但EBC中P53蛋白對(duì)孤立性肺結(jié)節(jié)早期肺癌篩查的敏感性和特異性較CEA和miRNA21低（AUC 0.706，P>0.05），可能與EBC中P53蛋白來自于除肺以外的多個(gè)部位如咽部、口腔等有關(guān)。本研究顯示，孤立性肺結(jié)節(jié)肺癌組EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表達(dá)水平，均高于非肺癌組與對(duì)照組（P<0.05），與性別、年齡、TNM、病理類型無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），三項(xiàng)指標(biāo)對(duì)早期肺癌診斷敏感性及特異性比較發(fā)現(xiàn)，CEA、miRNA21相比P53蛋白好，三項(xiàng)聯(lián)合檢測敏感性及特異性更高（AUC 0.931，P<0.05），能發(fā)揮不同檢測指標(biāo)優(yōu)勢(shì)，達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提高孤立性肺結(jié)節(jié)早期肺癌的篩查準(zhǔn)確率，改善患者預(yù)后，值得臨床試驗(yàn)性應(yīng)用并進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，聯(lián)合檢測呼出氣冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21有助于孤立性肺結(jié)節(jié)早期肺癌的篩查，提高診斷的敏感性和特異性。

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（收稿日期：2017-09-28）