329例胎兒常見染色體非整倍體的快速檢測

李 瓊，劉敏娟，何 丹，劉 歡，解 敏，王 挺，李 紅，李海波

（1南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心，江蘇蘇州215002；2廣州市達瑞生物技術股份有限公司，廣東廣州510665）

0 引言

非整倍體與人類疾病關系的研究已逾50年的歷史，是人類發育障礙和智力殘疾最常見的遺傳原因［1］。染色體數目異常被認為是最常見的自然流產病因［2-4］，給孕婦帶來了沉重的心理和生理的傷害［5］，且有些常染色體和性染色體非整倍體的胎兒能夠存活下來，這些患兒多伴隨嚴重的肢體、器官畸形和語言智力障礙，給家庭和社會造成了沉重的負擔。最常見的就是21三體、18三體、13三體以及性染色體異常。

自 1993年 Mansfield等［6］用定量熒光 PCR（quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR）進行唐氏綜合征及其他染色體非整倍體檢測以來，QF-PCR技術被證明為一種快速、準確、低成本、自動化程度高的檢側染色體非整倍體的方法，在國外得到廣泛的應用［7-9］。該方法是通過對染色體上多態性位點的短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）進行擴增，經過高分辨率膠電泳（如毛細管電泳等）對產物進行分離。由于引物的熒光信號強度和擴增產物量成正比，產物量與模板量成正比，進而實現對初始模板的相對定量，以對染色體數目異常進行有效快速的產前診斷。

本研究采用QF-PCR方法與染色體核型分析方法對329例產前羊水標本進行檢側，考察新近國產QF-PCR試劑盒對常見染色體非整倍體病檢測中靈敏性、特異性和準確性，評價其在染色體非整倍體快速產前診斷中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2016年3月至2016年12月因血清學篩查21／18染色體高風險、無創產前基因檢測提示21／18／13／X／Y 染色體高風險、高齡或 B 超異常等原因在蘇州市立醫院生殖與遺傳中心進行產前診斷的329例羊水樣本。孕婦年齡范圍19～43歲，其中35歲以下有189例（占57.45%），35歲及以上有140例（占42.55%）。在B超介導下進行羊水穿刺取樣，羊水穿刺的孕周為16～22+6周，經孕婦知情同意后，進行G顯帶核型分析后單盲進行QF-PCR檢測。

1.2 主要試劑 核酸提取或純化試劑（中山大學達安基因股份有限公司）；臨床試驗用21、18、13三體和性染色體非整倍體檢測試劑盒（廣州市達瑞生物技術股份有限公司）。

1.3 主要儀器 Applied Biosystems定性 PCR儀9700型；Applied Biosystems基因分析儀3500 Dx型。

1.4 方法

1.4.1 染色體核型分析 在超聲儀定位下，無菌操作行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL，置于2只無菌離心管中離心沉淀羊水細胞，接種培養基進行培養。常規方法制備染色體、G顯帶，必要時行父母外周血染色體核型分析。用染色體分析軟件進行分析，參考“人類細胞遺傳學國際命名體制2016版”相關規范標準（an international system for human cytogenetic nomenclature，ISCN 2016），用染色體圖像分析系統計數60個分裂相，鏡下分析10個核型，并2次復查。

1.4.2 QF-PCR 檢測位點 QF-PCR 檢測采用 21、18、13及性染色體上的18個STR位點，其中21號染色體6個位點，18號染色體4個位點，13號染色體4個位點，性染色體4個位點，另外還包括牙釉蛋白基因（amelogenin，AMXY）和性別決定基因（homo sapiens sex determining region Y，SRY）2個基因位點。每一個檢測位點引物對的上游或者下游引物用FAM（藍色）或HEX（綠色）熒光物質標記。20個檢測位點按照21、18、13三體和性染色體非整倍體檢測試劑盒（熒光PCR毛細管電泳法）說明書要求分A、B、C三組進行，其中A組包括21號染色體6個STR位點（A1-A6）；B組包括 18號染色體4個STR位點（B1-B4）和13號染色體4個STR位點（B5-B8）；C組包括4個 X染色體STR 位點（C2、C3、C5、C6）和2個性別基因位點（C1、C4）。

1.4.3 QF-PCR檢測步驟 主要操作包括：①DNA提取：按照中山大學達安基因股份有限公司生產的核酸提取或純化試劑的說明書進行。②PCR擴增：按照21、18、13三體和性染色體非整倍體檢測試劑盒（熒光PCR毛細管電泳法）說明書操作，具體擴增體系分三組，擴增體積為 25 μL，擴增反應條件為 95℃5 min；隨后變性 95℃ 30 s，退火 58℃ 40 s，延伸 72℃50 s，共25個循環；最后72℃延伸10 min。③毛細管電泳：取 1 μL PCR 產物和 13.5 μL 甲酰胺、0.5 μL GeneScanTM600 LIZ?Size standard v2.0（內標）混合，95℃變性5 mim，放置冰上至少1 min，用3500 Dx型基因分析儀進行毛細管電泳。

1.4.4 QF-PCR結果判斷及統計學方法 ①結果分析及判斷標準：對3500 Dx型基因分析儀電泳得到的數據應用GeneMapper?軟件進行分析。根據既往大樣本陽性、陰性樣本的統計得出：檢測位點為單峰或者兩個等位基因熒光峰面積比在0.8～1.4為正常樣本峰型，檢測位點為兩個等位基因熒光峰面積比在0.45～0.65或 1.8～2.4 或者三個等位基因熒光峰面積比接近1∶1∶1（最大峰面積與最小峰面積比值范圍為1～1.4）則為三體峰型。至少有兩個位點結果符合一個正常峰型才能解釋該反應結果為陰性（圖1）；至少兩個位點結果符合一個三體峰型才能解釋該反應結果為陽性（圖2）。②統計學分析：試驗結果統計分析選用所有符合試驗方案要求的受試者樣本數據進行統計分析，主要采用四格表整理試驗數據。QF-PCR檢測結果和染色體核型分析結果對比采用Kappa一致性檢驗，Kappa值的P≤0.01被認為所檢驗的結果有統計學意義。

圖1 陰性結果示意圖（所有位點結果均為正常峰型，判斷該樣本為陰性）

圖2 陽性結果示意圖——以21三體為例（A組有5個位點結果為三體峰型（A1、A3為雙峰，峰面積比在 1.8～2.4范圍內；A2、A5、A6為三峰，峰面積比接近 1 ∶1 ∶1；A4多態性不能提供有效信息），綜合判斷該樣本為21三體陽性）

2 結果

2.1 染色體核型分析結果 在檢測的329例羊水樣本中，染色體核型分析檢測到 21、18、13、X、Y 染色體非整倍體87例，其中1例為21，13羅伯遜易位型的21三體。正常核型242例，具體染色體核型分析分布情況統計如表1所示。

表1 樣本染色體核型分析結果分布情況統計

2.2 QF-PCR檢測結果 在檢測的329例羊水樣本中，QF-PCR檢測結果陽性樣本87例，分別為21三體54例、18三體17例、13三體3例、性染色體非整倍體13例（XXX 7例，XXY 3例，XYY 3例）；陰性樣本242例。QF-PCR檢測與對比方法核型分析兩者檢測結果符合率為100%，但QF-PCR未能識別出是否為易位型的21三體。

2.3 統計學分析 試驗真實性評價：靈敏性、特異性、準確性、Kappa值等指標計算見表2。分別計算靈敏性、特異性、準確性。 靈敏性＝87／（87+0）×100%＝100%，特異性＝242／（0+242）×100% ＝100%，準確性＝（87+242）／（87+0+0+242）×100%＝100%。

Kappa值采用 SPSS13.0軟件進行統計分析，Kappa值計算結果為 1.000（P＜0.01）。 結果表明QF-PCR檢測與核型分析兩者檢測結果無顯著差異，兩者檢測一致性極好。

表2 2種方法檢測結果的一致性評測表

3 討論

染色體非整倍體是指相對于人的正常的46條染色體而言，細胞中的某一條或幾條染色體數目增加或減少，與嬰幼兒期顯著的發病率和死亡率有著密切關系。其中21三體（唐氏綜合征）、18三體（愛德華氏綜合征）、13三體（帕陶氏綜合征）和性染色體非整倍體（XXY綜合征、XYY綜合征等）分別是常染色體和性染色體臨床最常見染色體病。此類疾病通常具有智力低下、器官多發畸形或第二性征發育異常等臨床表現，且目前對染色體病尚無有效的治療措施，此類患兒的出生將給家庭和社會帶來沉重的負擔［10］。因此，通過產前診斷有效阻止染色體缺陷患兒的出生尤為重要。

臨床主要采用傳統的染色體核型分析技術對大多數患者進行診斷，該技術雖然可以觀察整套染色體的數目和主要帶型，但這種方法操作繁瑣、耗費人力、技術要求高，出報告時間長（2～3周），易增加孕婦焦慮情緒，還可能會錯過后續最佳醫學處理時機［11］。隨著分子診斷的發展，QF-PCR技術在產前診斷中的應用越來越廣泛［11-15］，此技術可以在數小時內檢測常見的染色體數目異常，具有快速、準確、低成本、高敏感性和高特異性的優點，并且能夠自動化操作。

本研究中329例產前診斷樣本，QF-PCR和對比方法（金標準染色體核型分析法）均檢測出陰性樣本242例，陽性樣本87例，包括21三體54例、18三體17例、13三體3例、性染色體非整倍體13例（XXX 7例，XXY 3例，XYY 3例）。其中1例核型分析結果是21，13羅伯遜易位型的21三體，QF-PCR檢測結果為21三體，說明QF-PCR可以對羅伯遜易位型的21三體進行準確檢測，但不能明確其為易位型，鑒于易位型21三體同常規21三體造成的臨床結局一致，是檢測目標不同不屬于漏檢。本研究結果表明QFPCR技術在檢測這五種非整倍體上靈敏性、特異性和準確性均為 100%，Kappa 值為 1.000（P＜0.01），兩者檢測結果無顯著差異，一致性好。

STR位點的合理選擇和體系設計可使QF-PCR檢測染色體非整倍體異常檢測結果更準確可信［16］。本研究中QF-PCR檢測采用的是廣州市達瑞生物技術股份有限公司研制開發的21、18、13三體和性染色體非整倍體檢測試劑盒（熒光PCR毛細管電泳法），該試劑盒采用21、18、13及性染色體合計18個STR位點，其中21號染色體6個位點，18號染色體4個位點，13號染色體4個位點，性染色體4個位點，另外還包括牙釉蛋白基因（AMXY）和性別決定基因（SRY）2個基因位點。該試劑盒分三個體系同時進行檢測，分別為A組（21號染色體）、B組（18和13號染色體，18和13號染色體上的位點顏色不同）和C組（性染色體），同一條染色體的位點集中在一個檢測體系中，使檢測易于實現實驗操作和結果判讀的標準化和規范化，降低人工操作和判斷的出錯率。在329例QF-PCR檢測結果中，未出現單條染色體全部STR位點純合以致結果無法判讀的情況，核型分析檢測到的所有正常核型用QF-PCR檢測均無染色體數目異常，21、18、13、X及 Y五種染色體非整倍體用QF-PCR技術均可全部檢出，無假陽性。說明該試劑盒針對選擇的位點及相應數目合理，體系設計穩定可行，具有較高的臨床應用價值。

以QF-PCR技術開發的國產化快速檢測試劑盒具有較好的靈敏性和特異性，可作為染色體核型分析的重要補充，優化完善產前診斷體系，不論是減輕長時間等待診斷結果給孕婦及其家屬帶來的心理壓力，還是幫助產科醫生及時做出處理措施方面都有重要的臨床應用價值。因此，如果能將這一技術更好地與我國醫療實際相結合，必將更好地服務于臨床。

【參考文獻】

［1］MacLennan M， Crichton JH， Playfoot CJ， et al.Oocyte development， meiosis and aneuploidy［J］.Semin Cell Dev Biol，2015，45：68-76.

［2］鐘 韻，偶 建，李 紅.胎兒染色體檢查在復發性流產患者中的應用價值［J］.國際生殖健康／計劃生育雜志，2017，36（1）：61-65.

［3］Andrews WW.What is new in stillbirth： Important recent articles［J］.Obstet Gynecol，2015，125（1）：160-161.

［4］Suciu N， Plaiasu V.A time stamp comparative analysis of frequent chromosomal abnormalities in Romanian patients［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2014，27（1）：1-6.

［5］白 帆.習慣性流產患者的心理特點與護理干預［J］.轉化醫學電子雜志，2015，2（6）：138-139.

［6］Mansfield ES.Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms［J］.Hum Mol Genet，1993，2（1）：43-50.

［7］Adinolfi M， Sherlock J.Prenatal detection of chromosome disorders by QF-PCR［J］.Lancet，2001，358：1030-1031.

［8］Brown L， Abigania M， Warburton D， et al.Validation of QF-PCR for prenatal aneuploidy screening in the United States［J］.Prenat Diagn，2006，26（11）：1068-1074.

［9］Cirigliano V， Voglino G， Ordo?ez E， et al.Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR，results of 9 years of clinical experience ［J］.Prenat Diagn，2009，29（1）：40-49.

［10］梁 麗，廖 燦.QF-PCR快速產前診斷染色體非整倍體應用研究［J］.中國優生與遺傳雜志，2011，19（11）：5-7.

［11］李發濤，廖 燦，李 焱，等.應用QF-PCR技術快速檢測2275例胎兒常見染色體非整倍體結果分析［J］.中國優生與遺傳雜志，2014，22（3）：39-41.

［12］Onay H， Ugurlu T， Aykut A， et al.Rapid Prenatal Diagnosis of Common Aneuploidies in Amniotic Fluid Using Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction［J］.Gynecol Obstet Invest，2008，66（2）：104-110.

［13］Driscoll DA， Gross S.Clinical practice.Prenatal screening for aneuploidy［J］.N Engl J Med，2009，360（24）：2556-2562.

［14］梁 麗，廖 燦，李發濤，等.QF-PCR技術在胎兒超聲異常病例快速產前診斷中的應用研究［J］.中國優生與遺傳雜志，2011，19（7）：57-59.

［15］紀 妍，朱 津，盧 燕.QF-PCR快速產前診斷常見非整倍體病的價值［J］.海南醫學，2016，27（1）：56-59.

［16］張曉娜.建立一種對21／18／13／X／Y 染色體數目異常進行聯合診斷的多重定量PCR體系［D］.唐山：河北聯合大學，2014.