分子篩層析分離蛋白質實驗條件的優化

尹燕霞, 佟 麗, 李小蒙, 向本瓊

(北京師范大學 國家級生命科學與技術實驗教學中心, 北京 100875)

在工業、醫藥、農林以及環境科學等專業的某些研究中,生物化學實驗技術都是重要的研究手段[1-3]。生物化學實驗教學是生物化學理論教學的有益補充,能夠幫助掌握生物化學基本知識,是剖析生命現象的重要工具[4]。生物化學實驗教學內容包含了經典的生物化學實驗內容,如離心技術、層析技術、電泳技術及分光光度計的使用等,其中的層析技術是生物化學實驗中最經典的實驗內容,特別是分子篩層析廣泛應用于生物化學、酶學、生物制藥等各個領域。尤其近幾年醫藥生物產業的迅速發展,已從實驗室的科學研究應用到工業生產中[5-7]。鑒于分子篩層析研究的重要性與實際應用的廣泛性,多年來分子篩層析一直是生物化學實驗課中的重要實驗項目[8]。

1 分子篩層析

分子篩層析又稱凝膠過濾,是利用分子大小來分離生物大分子混合物的方法之一[9]。凝膠過濾層析的洗脫體積Ve/外水體積V0與溶質分子量M成對數關系,洗脫幾個已知分子量的球蛋白,用Ve/V0對lgM作圖得到層析的標準曲線,然后在同樣條件下洗脫未知樣品,通過Ve/V0即可找出對應的lgM,可以算出分子量[10]。

我院本科生的生物化學實驗課內容主要包括分子篩層析分離標準蛋白(制作標準曲線)、堿性磷酸酶的表達、分離純化及其特性研究、變性及復性作用研究，以及堿性磷酸酶多克隆抗體的制備等。分子篩層析分離標準蛋白實驗一是讓學生要掌握這種經典的層析技術,二是分離純化得到的堿性磷酸酶需要用標準蛋白制作得到的標準曲線來計算其分子量的大小,所以分子篩層析分離標準蛋白得到的標準曲線的線性關系對學生后續實驗結果有很大影響。

以往,制作分子篩層析標準曲線選用的標準蛋白是藍色葡聚糖、γ-球蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、溶菌酶,其中溶菌酶在過分子篩層析時的結果總是不理想,基本收集不到溶菌酶,也就得不到其洗脫體積,其標準曲線的線性非常差,直接影響了后續實驗計算堿性磷酸酶的分子量。近幾年,選用Sephacryl S-200 HR作為凝膠填料,讓學生嘗試了一種新的蛋白細胞色素C,反復對層析條件進行篩選和優化,得到了理想的實驗結果,標準曲線的線性關系得到了極大改善，成功地用于本科實驗教學中。

2 材料與試劑

材料:Sephacryl S-200 HR ( GE Healthcare)，1.0×50 cm層析柱。

試劑:藍葡聚糖、卵清蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶、細胞色素C、γ-球蛋白購自sigma公司,其他試劑均為分析純。

標準蛋白溶液:用BufferA(50 mmol/L Tris-HCl,pH8.5；0.2 mol/L NaCl；0.5 mmol/L EDTA)分別配成不同濃度的藍葡聚糖、卵清蛋白、牛血清白蛋白、γ-球蛋白、溶菌酶、細胞色素C溶液。

3 實驗方法

將1.0 cm×50 cm層析柱洗滌干凈,豎直安裝。調整Sephacry S-200 HR凝膠懸液的比例為1∶1。 將層析柱的下端出口管連接到恒流泵上,把凝膠懸浮液一次連續傾入柱中,打開恒流泵,讓凝膠沉降。待凝膠下沉到一定高度時,用吸頭吸出液體部分,加入凝膠懸浮液,用玻璃棒在凝膠的交界面輕輕攪動,不斷重復此過程，待凝膠沉降的高度約48 cm左右為止。 旋擰好層析柱的上端接頭,上端接頭的進口管插入Buffer A中,平衡3個柱體積。 用藍葡聚糖檢測層析柱的質量。

將蛋白溶液或混合液配好后,12 000 r/min離心5 min。取合適體積的上清液進行上樣,加樣開始的同時要收集層析柱的流出液。

用Buffer A洗脫層析柱。核酸蛋白監測儀記錄洗脫峰。確定洗脫體積。

藍葡聚糖檢測層析柱的質量很好后,上樣各蛋白溶液,洗脫并測量各蛋白的洗脫體積。

4 結果與討論

本實驗以Sephacry S-200 HR分子篩層析為研究對象,對實驗過程中蛋白、蛋白濃度、上樣量、上樣順序等進行了篩選和優化。

4.1 蛋白及蛋白濃度的確定

多年的教學結果表明，卵清蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、γ-球蛋白能出現蛋白峰,但峰值偏小,特別是溶菌酶過完分子篩層析后基本上沒出任何蛋白峰。于是把卵清蛋白、牛血清白蛋白、γ-球蛋白濃度逐步提高,發現10 g/L的γ-球蛋白以及20 g/L的卵清蛋白與牛血清白蛋白出來的蛋白峰可以達到滿意的效果，而溶菌酶到100 g/L還未出峰。用與溶菌酶分子量相似的細胞色素C代替溶菌酶,發現100 g/L的細胞色素C的效果更好。經過多次反復實驗,最終確定卵清蛋白和牛血清白蛋白質量濃度為20 g/L，γ-球蛋白為10 g/L,細胞色素C為100 g/L,可以滿足實驗的要求,學生實驗重復效果較好(見圖1)。

4.2 樣品上樣量

樣品上樣量對實驗結果會造成較大的影響,加樣過多,會造成洗脫峰的重疊,影響分離效果；加樣過少,過柱后各組分量少、濃度較低,實驗效率低[11]。加樣量的多少要根據具體的實驗要求而定。一般，分離純化蛋白質時,加樣體積約為凝膠柱床體積的1%～5%。以20 g/L牛血清白蛋白為例,分別加入100 、200、300、400、500 μL的不同體積樣品液,以0.3 mL/min的流速洗脫,所得洗脫曲線見圖2。不同體積的上樣量,層析出來的峰值不同,峰型相近,達到一定量后峰的寬度變大。綜合各項因素得出樣品量Ve=200 μL時分離效果好,峰的對稱性好,雜質的干擾相對少些,達到了較滿意的效果。

4.3 流速和操作壓

洗脫速度慢樣品可以與凝膠基質充分平衡,分離效果好。但洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇、區帶變寬,反而會降低分辨率,而且實驗時間會大大延長，所以應根據實際情況來選擇合適的洗脫速度[12-13]。以20 g/L牛血清白蛋白為例,分別以0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min的流速洗脫,洗脫曲線見圖3。通過反復實驗,綜合考慮實驗內容與時間的安排,并結合后續堿性磷酸酶的分離純化實驗內容,確定了合適的流速為 18 mL/h(0.3 mL/min)。

采用恒流泵保持操作壓和流速恒定,在裝柱、上樣和層析過程中始終保持操作壓不變,從而保持流速不變。

圖1 各蛋白的洗脫曲線

圖2 不同的上樣量對分子篩層析分離的影響

圖3 不同的流速對分子篩層析分離的影響

4.4 上樣順序

分子篩層析裝柱后首先用藍色葡聚糖檢測裝柱的效果,如果藍色葡聚糖在層析柱中是均勻的、流動的,出來的峰對稱性也不錯,則表明裝柱成功，然后測定各個蛋白的洗脫體積。通過反復實驗,發現可以把卵清蛋白和藍葡聚糖混合上樣、把γ-球蛋白和卵清蛋白混合上樣、把牛血清白蛋白和細胞色素C混合上樣,都能得到很好的分離效果,又可以節省時間。上樣順序是:卵清蛋白和藍葡聚糖混合液—γ-球蛋白和卵清蛋白混合液—牛血清白蛋白和細胞色素C混合液。或者先上樣卵清蛋白和藍葡聚糖混合液,等2個蛋白峰都出現后再上10 g/L的γ-球蛋白,大約1.5 h后接著加入20 g/L牛血清白蛋白和100 g/L細胞色素C的混合液。這樣安排既可以節省時間,又可以保證每個蛋白都能很好地分離。

4.5 標準曲線的制作

各蛋白的分子量Mr及其洗脫體積Ve見表1。藍色葡聚糖-2000用來測定Sephacryl S-200 HR層析的外水體積V0。得到的Ve/V0-lgMr標準曲線見圖4。曲線的線性關系較好,易于重復,可以用于后續的實驗求未知蛋白的分子量。

表1 分子篩層析中得到的各參數

圖4 分子篩層析得到的標準曲線

經過優化后選定卵清蛋白、牛血清白蛋白、γ-球蛋白、細胞色素C為使用的標準蛋白,卵清蛋白與牛血清白蛋白質量濃度為20 g/L、γ-球蛋白質量濃度為10 g/L；細胞色素C質量濃度為100 g/L；每個樣品上樣量為200 μL。在相同實驗條件及參數設置情況下,4個本科生班級的學生做的分子篩層析標準曲線實驗結果非常相近,曲線的重復性較好。

5 結語

根據生物化學實驗課的教學特點,結合專業背景和發展需求,對傳統的、經典的分子篩層析實驗進行了改革與改進,并重新設計了實驗方案。引進了細胞色素C蛋白,建立了標準曲線所需的實驗蛋白濃度,明顯改進了分子篩標準曲線線性關系,將其用于實驗教學,受到學生喜愛,具有較好的推廣價值。

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