暗光缺氧條件下微囊藻的存活及胞內物質釋放

陳桂欽 ,彭 琳 ,黃瑩瑩 ,李盼盼 ,張海春 ,陳雪初 ,3* (.華東師范大學生態與環境科學學院,上海000；.上海市環境監測中心,上海 00030；3.上海城市困難立地綠化工程技術研究中心,上海 003)

藍藻水華爆發期間,沉降是影響水柱中藍藻生物量的重要因素[1-4],研究顯示沉降部分達到整個水柱藍藻生物量損失的30%[5].沉降至底泥-水界面的藍藻會受到暗光缺氧的脅迫.現有研究多集中在沉降藍藻的越冬機制,冬季藍藻通過形成休眠孢子[6],或者通過降低自身代謝水平來維持存活[7-10].然而,有研究顯示夏季從底泥中分離出的藍藻仍然存活并保持營養細胞狀態,其酯酶活性甚至更高[11].表明夏季高溫條件下,沉降藍藻可能保持存活狀態,但與冬季越冬行為有著完全不同的機制.與冬季休眠孢子保持低代謝水平不同的是,夏季沉降至底泥-水界面的藍藻依然保持正常甚至更高的代謝水平,其代謝產物將會影響底泥-水界面物質的生物地球化學循環.

夏季沉降藍藻在暗光缺氧脅迫下能夠保持存活,為證明這一假說,本研究模擬暗光缺氧條件,利用不同生長期的微囊藻進行存活實驗,并研究其有機碳、含氮物質及藻毒素的釋放情況.

1 材料與方法

1.1 藻類培養

試驗所用銅綠微囊藻(FACHB 942)購自中科院武漢水生生物研究所,培養溫度為(25±1)℃,光照強度為 4000lx,光暗比為 14h:10h,培養基為BG11.根據圖1所示生長曲線分別收集培養時間為12、28以及55d的微囊藻.取一定體積的藻液,以 4000r/min離心 10min,摒棄上清液,用無菌純水洗滌后以4000r/min離心10min,重復3次,用于后續實驗.

1.2 實驗設置

實驗條件設置為暗光缺氧.將清洗過的微囊藻用純水進行稀釋,12d組初始葉綠素 a (Chl a)濃度為 2.82mg/L,28d組初始 Chl a濃度為3.70mg/L,55d組初始Chl a濃度為4.20mg/L,每組設置 3個平行樣.利用 N2吹脫去氧(溶解氧濃度低于0.5mg/L),在N2保護下將藻液加入到血清瓶中,頂空,用密封瓶蓋密封瓶口,置于不透光黑色密封箱內,(25±1)℃條件下培養.該實驗為破壞性實驗,每3d隨機取3個血清瓶進行測定,取樣測定Chl a濃度、細胞存活率(Viable cell ratio)、釋放物中溶解性總有機碳濃度(DOC)、溶解性總氮(DTN)濃度、氨氮濃度、藻毒素(MCs)濃度,之后該組血清瓶不再利用.

1.3 分析方法

葉綠素a濃度用AquaPen手持式藻類熒光測量儀(Photon Systems Instruments, spol.s r.o.,Czech Republic)測量,存活率采用細胞分析儀測定(The Muse?Cell Analyzer, EMD Millipore Corporation, Germany),氨氮采用APHA標準法[12]測定,DOC、TN用總有機碳分析儀(Multi N/C 3100, Analytik Jena, Germany)測量,藻毒素采用微囊藻毒素檢測試劑盒(Express Technology Co.,Ltd)測定.

為了更好的表述數據,采用以下專用名詞:(1)存活率,活體微囊藻細胞數量占總細胞數量的比例; (2)單位葉綠素的DOC釋放量(mg C/mg Chl a),即為單位葉綠素的微囊藻釋放出 DOC的量,計算方法為將細胞釋放 DOC濃度(mg/L)除以Chl a濃度(mg/L); (3)單位葉綠素的DTN釋放量(mg N/mg Chl a),即為單位葉綠素的微囊藻釋放出DTN的量,計算方法為將細胞釋放DTN濃度(mg/L)除以Chl a濃度(mg/L); (4)單位葉綠素的MCs釋放量(mg MCs/mg Chl a),即為單位葉綠素的微囊藻釋放出 MCs的量,計算方法為將細胞釋放MCs濃度(mg/L)除以Chl a濃度(mg/L).實驗組和對照組參數采用方差分析法(ANOVA)分析比較.

2 結果與討論

2.1 暗光缺氧條件下微囊藻細胞存活率及生物量變化

圖2為暗光缺氧條件下微囊藻存活率變化.細胞存活率可以直接表征微囊藻的存活情況,由圖可知,在暗光缺氧條件下,短期內細胞能夠維持較高存活率,之后迅速降低.其中28d組存活率降低最快,實驗第 6d降至 6.51%;而此時 55d組存活率仍然較高,為 84.08%;12d組則處于中等水平,實驗第6d存活率為32.99%.可知在暗光缺氧脅迫下,55d及 12d組存活時間可達 6d以上,28d組存活時間較短,低于 6d.總體而言,暗光缺氧脅迫下,藻細胞的存活時間 28d組<12d組<55d組.圖3為暗光缺氧條件下Chl a濃度在9d內的變化,用Chl a濃度表征微囊藻生物量.結果顯示,28d組 Chl a濃度降低較快,6d后由3.69mg/L降至2.27mg/L,此時12d和55d組Chl a濃度與初始值相比沒有明顯降低,第 9d兩組的Chl a濃度開始降低.微囊藻Chl a的變化與其存活率變化相對應.

研究發現夏季水華期會有大量藍藻沉降至暗光缺氧的底泥-水界面[1-4].在黑暗和低溫條件下,微囊藻生長受到明顯抑制,N充足但黑暗條件下25d后微囊藻衰亡[13].陳雪初等[14]研究發現在23℃時,當光照度小于 500lx,微囊藻的生長會受到明顯抑制.Furusato等[10]研究表明經過 10d的黑暗限制之后,微囊藻生物量顯著下降,20d后降至初始細胞數量的1%.Shi等[15]研究發現在黑暗條件下,微囊藻比斜生柵藻適應能力更強,其細胞新陳代謝略微上升,且沒有明顯的細胞死亡.以上研究可知微囊藻在暗光環境下可以長期存活達20d左右,且代謝率并沒有大幅下降.本文研究發現,在模擬夏季底泥-水界面條件下,不添加氮源時微囊藻細胞可以存活達9d,表明微囊藻在暗光無氧的條件下仍然可以保持存活狀態.

圖1 微囊藻生長曲線Fig.1 The Growth curve of Microcystis

圖2 暗光缺氧條件下微囊藻存活率的變化Fig.2 Changes of the viable cell ratio under the dark/anoxic condition

圖3 暗光缺氧條件下微囊藻葉綠素濃度的變化Fig.3 Changes of Chlorophyll a concentration of Microcystis under the dark/anoxic condition

2.2 暗光缺氧條件下微囊藻DOC的釋放

由圖4可知,在實驗第3d,各實驗組細胞存活率均在80%以上,此時28d組的單位葉綠素DOC釋放量最高,達到1.86mg C/mg Chl a,12d及55d組分別為0.54、0.94mg C/mg Chl a.單位葉綠素DOC釋放量12d組<55d組<28d組.微囊藻存活率變化表明,12d和28d組微囊藻在實驗第3d時存活率在 90%以上,此時其 DOC釋放曲線斜率較小,3d之后細胞存活率迅速下降,而DOC釋放曲線斜率也同時增大.55d組微囊藻在實驗第 6d之后存活率降低,DOC釋放曲線的斜率同步增加.這表明,細胞存活率較高時,雖然會有部分死亡細胞分解釋放DOC,但此時大部分有機碳等是存活微囊藻在代謝過程中釋放的,一旦細胞死亡釋放有機碳,其濃度會迅速增加.表明微囊藻細胞不僅在死亡分解時能釋放有機碳,在存活的情況下依然可以釋放有機碳.表明暗光缺氧條件下,存活的微囊藻能夠釋放有機碳.現有研究發現太湖水體中膠體有積碳濃度為 1.79～2.05mg/L,占DOC的8.11%～22.13%[16].朱元榮[17]研究發現微囊藻水體中 TOC的主要物質為氨基酸.孔繁翔[18]的研究結果表明巢湖水體中總溶解性碳水化合物占(總有機碳)TOC的比例最高為 26%,多糖和單糖所占比例分別為 21%和 6%.藻細胞能夠通過光合作用固定無機碳,現有研究已經證明沉降藍藻死亡分解會釋放大量有機碳,從而促進水體生物脫氮作用[19-21],但目前少有研究關注活藻與底泥-水界面氮脫除之間的關系.本研究發現活藻同樣也會釋放有機碳,在暗光缺氧條件下,存活微囊藻細胞單位葉綠素的DOC釋放量可達到1.86mg C/mg Chl a.

研究結果顯示,在暗光缺氧條件下,細胞的存活和有機物釋放與其生長階段有關.現有研究表明,對數生長階段的藻細胞具有體積小,細胞壁薄,貯存物質少等特征[22].在此階段,細胞代謝活性最強,組成新細胞物質最快,同時對理化因素影響敏感.進入穩定期后,細胞開始積累貯藏物質,這一時期細胞數量達到了最高水平,產物積累也達到了高峰[23].本文使用培養了12、28及55d的微囊藻作為研究對象,圖 1生長曲線表明其分別處于對數期、穩定初期及穩定后期.結果表明,實驗第3d時,在暗光缺氧脅迫下28d組微囊藻DOC釋放量最高.這可能與藻細胞進入穩定期后,細胞內貯藏物質開始積累有關[24-25].培養 12d微囊藻處于對數期,藻細胞代謝活性最強,并且易受理化因素影響,細胞貯藏物質較少[22],其存活時間較穩定后期短,其胞外 DOC釋放也相應的較少.培養 55d微囊藻處于穩定后期,藻細胞內貯藏物質積累較多,同時其細胞代謝較對數期低[26],在暗光缺氧脅迫下可以存活相對較長的時間,DOC的釋放量處于中間水平,低于穩定初期,但高于對數生長期.

圖4 暗光缺氧條件下微囊藻DOC釋放Fig.4 Changes of DOC secreted by Microcystis under the dark/anoxic condition

2.3 暗光缺氧條件下微囊藻氮素的釋放

圖5顯示暗光缺氧條件下微囊藻氮素的釋放量逐漸增加.實驗第 3d,不同培養時間微囊藻的單位葉綠素 DTN 釋放量差別不大,均較低,而此時12d和55d組的單位葉綠素氨氮釋放量較高,尤其是12d組,其氨氮釋放量達到0.09mg N/mg Chl a;實驗第6d, 單位葉綠素DTN釋放量增加,與DOC釋放情況不同的是,12d組的TN釋放量最高,而存活率較高的兩組(12d和55d)氨氮釋放量相對較高.實驗結果表明存活微囊藻也能夠釋放氮素,但其釋放物的C/N較高,為3.00～7.83,表明暗光缺氧條件下微囊藻釋放的氮素利用自身釋放的 DOC即可通過生物反硝化過程去除,不會對水體產生額外的氮負荷.而相較于死藻,活藻有機會由于自身浮力調控機制或水體擾動(大風、湍流等)而重新上浮至真光層[27-29],通過光合作用重新積累有機碳,從而持續影響生物脫氮過程.

根據存活實驗結果及氨氮釋放情況推測,夏季沉降藍藻可能存在與越冬不同的存活機制,硝酸鹽異化還原成銨(DNRA)可能是微囊藻細胞保持存活的途徑之一.DNRA是將硝態氮轉化為可生物再利用的銨鹽[30].Kamp等[31]的研究表明硅藻可以利用細胞內的NO3-進行DNRA,從而可以在黑暗無氧的環境下長期存活.本研究表明,培養液中氨氮濃度呈上升趨勢,且12d和55d組細胞培養液中氨氮濃度較28d組高,相對應的12d和55d組細胞的存活率也較高.由此推測,暗光缺氧條件下微囊藻可能存在與海洋硅藻相類似的存活機制,即依靠DNRA過程來獲得能量從而維持生命活動,這一推測需要進一步研究.

圖5 暗光缺氧條件下微囊藻氮素釋放Fig.5 Changes of nitrogen secreted by Microcystis under the dark/anoxic condition(a):溶解性總氮;(b):氨氮

2.4 暗光缺氧條件下微囊藻毒素的釋放

圖6表明,實驗第3d,各組單位葉綠素藻毒素釋放量較低,均低于 8.73μg MCs/mg Chl a.實驗第 6d,55d組藻毒素釋放量最高,為 18.84μg MCs/mg Chl a;12d組藻毒素釋放量最低,為2.73μg MCs/mg Chl a.各組藻毒素釋放量隨著細胞存活率的降低而增加,其中 55d組藻毒素釋放量增加較大,另外兩組增加平緩.現有研究表明,夏季水體中藍藻沉降量能達到 15.00mg Chl a/m2[4-5],根據圖 6計算藻毒素釋放量低于 270μg MCs/m2,若水體深度為 2m,則釋放藻毒素濃度僅為 0.14μg/L,不會引起對水體中藻毒素濃度的急劇增加.

圖6 暗光缺氧條件下微囊藻毒素釋放Fig.6 Changes of MCs secreted by Microcystis under the dark/anoxic condition

3 結論

3.1 暗光缺氧脅迫下,微囊藻細胞能夠存活一段時間,而不同生長期的藻細胞存活時間不同,其中培養 55d的微囊藻存活時間最長,超過 6d;Chl a的變化與其存活率相對應,但變化程度較小.

3.2 暗光缺氧條件下,微囊藻能夠持續釋放有機碳、含氮化合物以及藻毒素等物質,且物質釋放量與其生長期相關.存活微囊藻細胞 DOC釋放量可達到 1.86mg C/mg Chl a,氨氮釋放量為0.09mg N/mg Chl a,釋放物的 C/N 較高,為3.00～7.83.

3.4 暗光缺氧條件下,微囊藻釋放出的藻毒素均低于8.73μg MCs/mg Chl a.

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