四溴雙酚A厭氧共代謝降解性能研究

陳英文,范夢(mèng)婕,孫靖云,沈樹(shù)寶 (1.石油石化污染物控制與處理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 1006；.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 10009)

作為一種廣泛應(yīng)用的溴系阻燃劑[1],四溴雙酚 A(TBBPA)在許多生物基質(zhì)中都有檢出[2],對(duì)人類健康具有嚴(yán)重危害[3].目前,TBBPA 的主要降解方法包括吸附法[4],光催化[5]和生物降解法[6].能夠原位修復(fù)污染物的生物降解是目前的研究熱點(diǎn).由于 TBBPA的特殊物化性質(zhì)使其易沉積于底泥沉積物厭氧環(huán)境中,因此研究TBBPA的厭氧降解更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn) Shewanella sp.XB的黃素分泌依賴于TBBPA的初始濃度,當(dāng)TBBPA初始濃度為80mg/L時(shí),黃素分泌受到了抑制.同時(shí),TBBPA降解產(chǎn)物分析顯示厭氧條件下 TBBPA只能被還原脫溴成雙酚 A(BPA)而不能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化[8].因此深入研究 TBBPA厭氧降解途徑具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.

厭氧共代謝是指通過(guò)微生物代謝其他化合物產(chǎn)生的酶或者輔助因子對(duì)污染物的降解過(guò)程[9-10].很多研究者利用微生物共代謝對(duì)環(huán)境中難降解有機(jī)物進(jìn)行去除,如 4-烷基酚(4-HBA)[11]和磺胺甲惡唑(SMX)[12].與 TBBPA 相同的是,4-HBA與SMX都具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,辛醇/水分配系數(shù)高,脂溶性強(qiáng)等特點(diǎn),因此推測(cè)厭氧共代謝技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)TBBPA的高效深度降解.

本文基于微生物厭氧共代謝原理,探索TBBPA厭氧共代謝可行性.構(gòu)建厭氧共代謝反應(yīng)器,分析研究 TBBPA 的厭氧共代謝降解效率.通過(guò)微生物特征菌群以及TBBPA降解途徑的研究探討 TBBPA的厭氧共代謝轉(zhuǎn)化機(jī)理,對(duì)研究厭氧環(huán)境中TBBPA深度降解具有重要科學(xué)意義.

1 材料與方法

1.1 反應(yīng)器的構(gòu)建與啟動(dòng)

構(gòu)建兩組反應(yīng)器,分別記為 C-Glu和 C-T,反應(yīng)器為圓柱形有機(jī)玻璃裝置,總?cè)萘繛?50mL.菌株來(lái)源為南京市某污水處理廠,經(jīng)葡萄糖底物溶液馴化,培養(yǎng)并保存.將營(yíng)養(yǎng)液和含有菌株的污泥按照 1:1的比例混合后添加進(jìn)反應(yīng)器中,以碳布作為微生物支撐載體,進(jìn)行馴化掛膜.營(yíng)養(yǎng)液由以下物質(zhì)組成:每升水中含葡萄糖 1.00g, NH4Cl 0.31g, KCl 0.13g,Na2HPO4·12H2O 11.88g, NaH2PO4·2H2O 2.55g,MgSO4·7H2O 0.20g 和微量元素 10mL.每 3d 更換一次營(yíng)養(yǎng)液,當(dāng)反應(yīng)出水溶液TOC低于40mg/L,且持續(xù)3次反應(yīng)循環(huán)時(shí),表明微生物掛膜完成.掛膜完成后,將兩組反應(yīng)器置于恒定溫度(33℃)的分批模式下操作,當(dāng)反應(yīng)出水溶液TOC趨于穩(wěn)定時(shí),更換底物,結(jié)束一次反應(yīng)循環(huán).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

以 1g/L葡萄糖作為反應(yīng)底物加入反應(yīng)器C-Glu;以1g/L葡萄糖作為共基質(zhì),將濃度分別為0,25,50,75,100,200和500μg/L的TBBPA按照葡萄糖溶液與TBBPA溶液體積比為7:3比例混合后依次加入反應(yīng)器 C-T,并根據(jù)葡萄糖在反應(yīng)系統(tǒng)中的降解特點(diǎn),分別在12, 24, 36和60h時(shí)取樣,為了排除數(shù)據(jù)的偶然性,TBBPA的每個(gè)濃度梯度都完成了4次降解反應(yīng).

以200μg/L TBBPA為唯一碳源,在反應(yīng)12h時(shí)取樣并通過(guò)質(zhì)譜分析中間代謝產(chǎn)物;以1g/L葡萄糖和200μg/L TBBPA混合溶液為碳源,在反應(yīng)12h時(shí)取樣并通過(guò)質(zhì)譜分析中間代謝產(chǎn)物.

1.3 分析方法

1.3.1 樣品的檢測(cè)與分析 ①樣品預(yù)處理.從反應(yīng)器中取15mL出水樣品與15mL二氯甲烷混合后,震蕩萃取10min,隨后將萃取液旋蒸至干.用甲醇定容到 3mL,用孔徑為 0.22μm 的有機(jī)系濾膜進(jìn)行過(guò)濾,完成樣品準(zhǔn)備.將處理好的樣品通過(guò)高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè).②質(zhì)譜條件.通過(guò)電噴霧電離(ESI)離子源,負(fù)離子模式及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行定性分析.氣簾氣(CUR),噴霧氣(GS1),輔助加熱氣(GS2)和碰撞氣(CAD)的壓力分別為 206851.8, 241327.1,275802.4和 41370.36Pa,源溫度為 400℃,離子化電壓(IS)為 5500V,母離子峰和子離子峰分別為542.7和417.9,碰撞能(CE),去簇電壓(DP),入口電壓(EP),碰撞室出口電壓(CXP)分別為-53, -75,-7和-10V.③液相色譜條件.在ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150mm×2.1mm,3.5μm), 0.02%(V/V)氨水(A)/50%甲醇(B)作流動(dòng)相,柱溫為40℃,進(jìn)樣量為5μL的條件下對(duì)TBBPA進(jìn)行定量分析.測(cè)量時(shí)所采用的流動(dòng)相梯度見(jiàn)表1.

表1 分析TBBPA的流動(dòng)相梯度Table 1 Gradient elution program for the analysis of TBBPA

1.3.2 生物多樣性分析 待反應(yīng)完成后,從不同反應(yīng)體系中的陽(yáng)極生物膜上取生物膜樣品作為檢測(cè)對(duì)象,反應(yīng)器C-Glu中生物膜記為C-Glu,反應(yīng)器C-T中生物膜記為C-T.將生物膜樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在 Illumina平臺(tái)上利用細(xì)菌16S rRNA測(cè)序分析微生物多樣性.

1.3.3 計(jì)算方法 TBBPA的產(chǎn)物通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行分析,TBBPA的濃度通過(guò)高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS)進(jìn)行檢測(cè).TBBPA去除率的計(jì)算方法為:

反應(yīng)一級(jí)速率常數(shù)的計(jì)算公式為

式中:C0為 TBBPA 的初始濃度,μg/L;Ct為TBBPA在反應(yīng)時(shí)間為t時(shí)的濃度,μg/L;k為速率常數(shù).

TBBPA半衰期的計(jì)算公式為

式中:ΔRT為TBBPA的去除率;C1為TBBPA的進(jìn)水濃度,μg/L;C2為 TBBPA 的出水濃度,μg/L;t為反應(yīng)時(shí)間;T為TBBPA的半衰期.

2 結(jié)果與討論

2.1 TBBPA降解效率分析

TOC代表溶液中總有機(jī)碳成分,即溶液中微生物能夠直接代謝的總碳源.在 12h前,溶液TOC快速下降(圖1),TOC去除率達(dá)到60%左右(圖2),12h后溶液TOC下降緩慢(圖1).當(dāng)出水溶液TOC低于40mg/L時(shí),完成一次反應(yīng)循環(huán),即此時(shí)反應(yīng)溶液中的有機(jī)碳源已不足以供給微生物,微生物處于饑餓狀態(tài).當(dāng)?shù)诙螤I(yíng)養(yǎng)底物加入時(shí),微生物的代謝活性能夠迅速提高直至營(yíng)養(yǎng)物被消耗,之后微生物的活性又回復(fù)到較低水平,從底物加入至底物耗盡,微生物經(jīng)歷飽腹至饑餓的循環(huán).因此,12h后直至反應(yīng)完成的TOC下降幅度小于在12h前的下降幅度.由圖1和圖 2亦可知隨著 TBBPA濃度的升高,出水TOC升高,TOC去除率下降,一方面是因?yàn)門BBPA對(duì)微生物的毒性作用[13],一方面是由于TBBPA的物化性質(zhì)與化學(xué)結(jié)構(gòu)使其難于被微生物代謝及轉(zhuǎn)化.

不同濃度TBBPA在厭氧共代謝條件下的降解動(dòng)力學(xué)分析如表2所示.由表2可知,在厭氧共代謝條件下,TBBPA的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程.而有機(jī)化合物的生物半衰期代表了其在生物條件下的轉(zhuǎn)化及降解速度,TBBPA的生物半衰期及降解時(shí)間隨著 TBBPA濃度的升高而升高,最低生物半衰期為 25μg/L時(shí)的 21.9h,最高生物半衰期為500μg/L時(shí)的64.4h,相比于自然環(huán)境及其它研究者報(bào)道(表 3),厭氧共代謝顯著縮短了TBBPA的生物半衰期.由圖3可知,濃度為75μg/L時(shí)的TBBPA在不同時(shí)間點(diǎn)去除率都高于其他濃度,結(jié)合不同濃度 TBBPA在反應(yīng)完成時(shí)最終去除率都高于75%的分析可知,TBBPA在厭氧共代謝體系中被還原脫溴,進(jìn)一步地,結(jié)合 TOC分析(圖 1和圖 2)可知,在厭氧共代謝體系中 TBBPA很大程度上被共代謝分解而成為微生物可利用的碳源.因此,TBBPA在厭氧共代謝體系中實(shí)現(xiàn)了有效降解.

圖1 不同TBBPA濃度條件下TOC隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.1 TOC of different concentrations of TBBPA at different time points

圖2 不同TBBPA濃度條件下TOC去除率隨時(shí)間的變化規(guī)律Fig.2 TOC removal rates of different concentrations of TBBPA at different time points

表2 不同濃度下TBBPA的降解動(dòng)力學(xué)研究Table 2 Kinetic results of TBBPA with different conentrations

表3 不同研究所做TBBPA厭氧降解效率對(duì)比Table 3 The comparison of anaerobic degradation efficiency of TBBPA by different researches

圖3 不同TBBPA濃度條件下TBBPA去除率隨時(shí)間的變化規(guī)律Fig.3 The removal rate of TBBPA with different concentrations at different degradation time

2.2 TBBPA厭氧共代謝途徑

已有研究證明在厭氧環(huán)境中 TBBPA只能被還原脫溴為BPA[8],不能進(jìn)一步進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化.本文也對(duì)以 TBBPA為單一碳源的厭氧降解進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),分析發(fā)現(xiàn) TBBPA的厭氧代謝終產(chǎn)物除了BPA未有其他單環(huán)產(chǎn)物檢出.而厭氧共代謝系統(tǒng)中代謝產(chǎn)物不僅存在BPA(圖4A),還存在單環(huán)產(chǎn)物3,4-二甲氧基苯甲酸甲酯(圖4B).有研究表明苯甲酸和對(duì)羥基苯甲酸都可以被微生物有效降解[17],因此推測(cè)化學(xué)結(jié)構(gòu)相似于苯甲酸和對(duì)羥基苯甲酸的 3,4-二甲氧基苯甲酸甲酯也是一種易于降解的化合物,充分證明了 TBBPA在厭氧共代謝系統(tǒng)中能夠被深度降解.

圖4 TBBPA的中間代謝產(chǎn)物Fig.4 The mass spectrometry analysis of TBBPA degradation products

圖5 TBBPA在厭氧共代謝系統(tǒng)中的降解途徑Fig.5 A proposed degradation pathway of TBBPA in conventional co-metabolic reactor

作為 TBBPA 厭氧共代謝的共基質(zhì),葡萄糖一方面緩解 TBBPA對(duì)微生物的毒性[18],另一方面為TBBPA 的分解及轉(zhuǎn)化提供質(zhì)子和電子.厭氧還原脫鹵作用是芳香族化合物在環(huán)境中礦化的關(guān)鍵步驟[19].由圖4可知,在厭氧共代謝條件下,TBBPA首先厭氧還原脫溴成 BPA,隨后通過(guò)氧化,分解及其它共代謝協(xié)同作用將BPA轉(zhuǎn)化成單環(huán)產(chǎn)物3,4-二甲氧基苯甲酸甲酯,并最終將TBBPA轉(zhuǎn)化成H2O和CO2,實(shí)現(xiàn)TBBPA的深度降解(圖5).

當(dāng)以葡萄糖為共代謝底物時(shí),不僅檢測(cè)到了雙環(huán)產(chǎn)物雙酚A,還檢測(cè)到了TBBPA的單環(huán)產(chǎn)物.結(jié)合 TBBPA的生物半衰期(表 2)和反應(yīng)結(jié)束時(shí)不同濃度下 TBBPA 去除率(圖 3)分析可知,TBBPA在反應(yīng)體系中是被共代謝降解而非其他代謝方式.

2.3 微生物特征分析

在Illumina平臺(tái)通過(guò)16S rRNA對(duì)反應(yīng)完成后的菌群進(jìn)行微生物多樣性分析,確定代謝轉(zhuǎn)化TBBPA的特征菌群.香農(nóng)指數(shù)被認(rèn)為是微生物多樣性指數(shù),香農(nóng)曲線越平緩表明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大,能反映微生物樣品中的大部分信息[20],C-Glu反應(yīng)體系和 C-T反應(yīng)體系中香農(nóng)指數(shù)分別為3.46和3.60,這表明TBBPA的加入引起了C-Glu和C-T兩個(gè)樣品之間微生物多樣性的差異.

由圖6可知,在厭氧共代謝系統(tǒng)中,只以葡萄糖為降解底物時(shí),Blvii28_wastewater-sludge和PHOS-HE36兩種菌株為主要菌屬, Blvii28_wastewater-sludge通常在厭氧廢水或淡水環(huán)境中,是污泥中的典型菌屬[21],PHOS-HE36是一種能夠以葡萄糖作為碳源的厭氧菌屬[22].而相較于厭氧共代謝系統(tǒng),TBBPA厭氧共代謝體系中固氮弧菌屬和毛球菌屬所占豐度比例分別為 11%和19%.這種現(xiàn)象的發(fā)生說(shuō)明TBBPA的加入促使固氮弧菌屬和毛球菌屬豐度增加,成為了C-T反應(yīng)體系中的優(yōu)勢(shì)菌屬.固氮弧菌屬屬于變形菌門,是一種兼性厭氧產(chǎn)電菌,最主要的兩個(gè)特征是利用有機(jī)碳作為碳源及對(duì)氮的固定[23].近年來(lái),很多研究者集中于固氮弧菌屬對(duì)苯系物(BTEX)降解能力的研究[24].另外,研究者發(fā)現(xiàn)固氮弧菌屬可以有效降解高效氯氰菊酯[25].毛球菌屬屬于厚壁菌門,是一種常從污泥中分離出來(lái)的兼性厭氧菌,能夠在厭氧反應(yīng)器中處理有機(jī)廢水[26].同時(shí),Sun等[27]發(fā)現(xiàn)毛球菌屬具有能夠降解剛果紅的能力,而剛果紅為一種極難生物降解的聯(lián)苯胺類偶氮染料.因此,結(jié)合 TBBPA 降解途徑,TBBPA 降解效率分析,可以推測(cè)固氮弧菌屬和毛球菌屬是厭氧共代謝降解TBBPA的特征菌屬.

圖6 微生物群落組成圖(屬)Fig.6 The composition of microbial community (genus)

3 結(jié)論

厭氧共代謝降解 TBBPA研究表明,在 12h時(shí),溶液TOC去除率達(dá)到60%左右,最低生物半衰期為 25μg/L時(shí)的 21.9h,最高生物半衰期為500μg/L時(shí)的64.4h,濃度為75μg/L時(shí)的 TBBPA去除率最高,且不同濃度 TBBPA的去除率都高于70%.微生物群落結(jié)構(gòu)及TBBPA中間代謝產(chǎn)物分析表明固氮弧菌屬和毛球菌屬為代謝TBBPA的特征菌屬.

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