城市污水廠MCR-1基因及其攜帶菌的污染

馬 奔,黃雅夢(mèng),王若楠,王新宇,曹振華,張 媛,張青云,徐炳乾,袁青彬 (南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京 211816)

近年來(lái),隨著醫(yī)療和養(yǎng)殖等行業(yè)的快速發(fā)展,抗生素的濫用也愈加普遍.我國(guó)抗生素生產(chǎn)與使用數(shù)量均居世界前列,抗生素的濫用和污染相當(dāng)嚴(yán)重.據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)抗生素人均消費(fèi)達(dá)138g/a,遠(yuǎn)高于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家,養(yǎng)殖業(yè)也長(zhǎng)期存在抗生素濫用現(xiàn)象[1].抗生素的過(guò)量使用導(dǎo)致環(huán)境中細(xì)菌抗藥性快速產(chǎn)生和發(fā)展,多種抗性基因在我國(guó)很多河流、沉積物、飲用水甚至空氣中被檢出[2-5].其易傳播、難消除的特點(diǎn)可能產(chǎn)生嚴(yán)峻的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn),也成為水處理過(guò)程中新的難題.石娜等研究發(fā)現(xiàn),低于 1000W 劑量的可見(jiàn)光+紫外輻照很難影響耐環(huán)丙沙星細(xì)菌的耐藥性[6].

城市污水處理廠廣泛接納各類(lèi)廢水,成為環(huán)境中抗性基因及其攜帶菌的重要儲(chǔ)存庫(kù).已在我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)眾多污水廠檢出多種抗性基因[7-8].污水處理過(guò)程難以徹底去除抗性基因及其攜帶菌,甚至?xí)龠M(jìn)抗性基因的傳播和造成細(xì)菌耐受抗生素水平的增強(qiáng)[8-10].

2015 年底,我國(guó)學(xué)者從患者和動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了耐粘菌素細(xì)菌而受到廣泛關(guān)注,粘菌素被認(rèn)為是對(duì)抗多重抗性細(xì)菌的“最后一道防線”.分析發(fā)現(xiàn)其都攜帶了一種新的耐粘菌素基因 MCR-1.隨后在抽檢我國(guó) 5省 804頭牲畜中,發(fā)現(xiàn)其中 21%攜帶MCR-1[11].目前,已有超過(guò)30個(gè)國(guó)家陸續(xù)檢出該基因[12-15].MCR-1基因位于質(zhì)粒,可很容易地傳遞到其他細(xì)菌.攜帶 MCR-1的大腸桿菌不僅對(duì)粘菌素具有抗性,通常還對(duì)多種其他抗生素表現(xiàn)耐藥性.然而當(dāng)前對(duì)于 MCR-1基因的研究主要集中在動(dòng)物體內(nèi)和臨床領(lǐng)域,在環(huán)境中研究非常稀少.

本文以南京某城市污水處理廠為研究對(duì)象,考察了 MCR-1和 MCR-1攜帶菌的污染特征,包括分布特征及其影響因素,進(jìn)而探索了MCR-1攜帶菌對(duì)粘菌素的耐藥特征及其隨污水處理流程的變化.本研究可為評(píng)價(jià)污水中超級(jí)抗性細(xì)菌及其基因的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供參考.

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和預(yù)處理

圖1 南京市某污水廠處理工藝流程Fig.1 The treatment process of the wastewater treatment plant (WWTP) located in Nanjing

實(shí)驗(yàn)所取水樣來(lái)自南京市浦口區(qū)某污水廠,其日處理量為 7.5×104m3,污水約 80%來(lái)源于周?chē)用袢粘Ｉ钗鬯?另有 20%來(lái)自工業(yè)園區(qū)工業(yè)污水.污水處理流程見(jiàn)圖 1,主要處理單元為兩套并聯(lián)運(yùn)行的活性污泥法(包括CAST和MSBR),然后經(jīng)曝氣生物流化池(ABFT)深度處理,最終出水直接排放至長(zhǎng)江.設(shè)7個(gè)樣點(diǎn)位,分別為沉砂出水(INF)、CAST混合液(CAST)、MSBR混合液(MSBR)、曝氣生物池混合液(ABFT)、澄清池出水(ECB)、消毒出水(EFF)和剩余污泥(BIO)(如圖1所示).取樣于2016年2～4月進(jìn)行,共取樣4次,從相應(yīng)取樣點(diǎn)取約1L樣品至已滅菌不透光聚乙烯塑料瓶中,然后將取樣瓶放置于冰盒并在2h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,所有樣品在12h內(nèi)處理和分析.

1.2 水質(zhì)分析分析項(xiàng)目包括進(jìn)水和出水樣品的化學(xué)需氧量(COD)、氨氮(NH3-N)、總氮(TN)、硝酸鹽氮(NO3--N)和亞硝酸鹽氮(NO2--N).測(cè)定方法參見(jiàn)表1.

表1 水質(zhì)指標(biāo)及其測(cè)定方法Table 1 Wastewater quality indexes and their detection methods

為評(píng)價(jià)常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)對(duì)污水廠出水MCR-1基因豐度的影響,對(duì)樣品進(jìn)行常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)分析.

1.3 DNA提取和定量PCR測(cè)定抗性基因濃度

樣品經(jīng) 0.22μm微孔濾膜過(guò)濾以富集微生物,過(guò)濾后的濾膜剪成小碎片后加入DNA提取管,采用DNA提取試劑盒(FastDNA Spin Kit for Soil,MP Biomedicals, CA, USA)進(jìn)行DNA提取,提取過(guò)程參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū).提取的DNA用瓊脂糖凝膠電泳(Biolab,USA)進(jìn)行鑒定,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并連接至質(zhì)粒克隆后作為抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品.

應(yīng)用LightCycler 96(ROCHE)熒光定量PCR進(jìn)行定量檢測(cè).MCR-1基因信息列于表2,所采用的引物已被前人文獻(xiàn)進(jìn)行了驗(yàn)證[8,21],同時(shí)監(jiān)測(cè)樣品中16S含量以獲得MCR-1的相對(duì)豐度.引物由金斯瑞生物科技有限公司合成.

表2 MCR-1和16S基因的信息以及定量PCR操作條件Table 2 Information of MCR-1and 16S rDNA and their quantitative PCR operating conditions

將含上述基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒經(jīng)10倍梯度稀釋作為模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.采用 20μL熒光定量PCR 反應(yīng)體系, 包括模版 1μL,正向、反向引物(10μM)各0.4μL,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(天根生物科技公司,北京)10μL,ddH2O 8.2μL.反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 15min→(95℃ 10s→表 2中退火溫度30s, 40個(gè)循環(huán)),生成溶解曲線.每個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)行3次平行測(cè)定,PCR擴(kuò)增效率為88%～110%,確保標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R ＞ 99%.

測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的同時(shí)進(jìn)行樣品的定量 PCR反應(yīng),體系和反應(yīng)程序和相應(yīng)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線保持一致,每個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)行3次平行測(cè)定.確保平行樣品之間偏差<5%,否則應(yīng)重新測(cè)定.根據(jù)樣品的循環(huán)數(shù)(CT)計(jì)算其濃度.

1.4 耐粘菌素細(xì)菌濃度測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品中耐粘菌素細(xì)菌濃度.首先將樣品在搖床中震蕩以充分混合,經(jīng) 10倍連續(xù)梯度稀釋.然后取 1mL若干稀釋度的樣品分別置于滅菌培養(yǎng)皿,加入含粘菌素(16mg/L)的 LB培養(yǎng)基(Tryptone 10g/L、Yeast Extract Powder 5g/L、NaCl 10g/L、Agar 15g/L)后充分搖蕩以混合培養(yǎng)基和樣品,待冷卻凝固后放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h,統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)在20～ 300CFU/mL的培養(yǎng)皿,確定耐粘菌素細(xì)菌的數(shù)目.每個(gè)梯度濃度的樣品均設(shè)置3個(gè)平行樣.濃度值的選取依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) 2011發(fā)布的耐藥性標(biāo)準(zhǔn)CLSI(2011版),取各病原菌對(duì)粘菌素具有耐藥性的最低抑菌濃度(MIC)中的最大值.

1.5 MCR-1攜帶菌株的分離和耐藥特征測(cè)定

采集的水樣經(jīng)過(guò)梯度稀釋和多次劃線分離,每個(gè)點(diǎn)位分離若干種菌株,將所有菌株進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,篩選MCR-1攜帶菌,PCR引物參見(jiàn)表2[21],采用50μL體系,包括菌液2μL、正向、反向引物各 1μL,Taq II(Takara)20μL 和 ddH2O 18μL.反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 15min→(95℃ 10s→55℃ 30s→72℃ 30s,35個(gè)循環(huán))→72℃ 5min.每個(gè)點(diǎn)位得到 7株MCR-1攜帶菌,將其加入20%甘油,保存于-20℃冰箱中備用.

采用牛津杯法測(cè)定MCR-1攜帶菌對(duì)粘菌素的耐藥特征,主要操作如下:在培養(yǎng)皿中倒入10mL LB培養(yǎng)基,隨后放入已滅菌的牛津杯,待冷卻后取出牛津杯,將得到由牛津杯所形成的孔洞,每個(gè)菌種制作3個(gè)牛津杯平板.涂布200μL菌液后于孔洞中分別加入 7種不同濃度的粘菌素(150,200,300,400,600,700,1000mg/L),37℃恒溫培養(yǎng) 24h后,使用游標(biāo)卡尺測(cè)量形成的抑菌圈的直徑,取平行實(shí)驗(yàn)所得抑菌圈直徑的平均數(shù),記錄數(shù)據(jù)并分析.

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Canoco 4.5軟件考察MCR-1及粘菌素耐藥菌豐度與水質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性.物種數(shù)據(jù)為MCR-1及粘菌素耐藥菌濃度,環(huán)境因子為監(jiān)測(cè)的水質(zhì)指標(biāo)的濃度.首先,對(duì)物種矩陣進(jìn)行除趨勢(shì)(DCA)分析,得出第一排序軸長(zhǎng)度相對(duì)較短(<4),所以選用線性模型RDA對(duì)物種組成數(shù)據(jù)與環(huán)境因子進(jìn)行多元相關(guān)性分析;再采用手動(dòng)選擇方式,用Monte Carlo permutation test檢驗(yàn)顯著性,置換次數(shù)為 999,找出顯著影響(P<0.05)的環(huán)境因子;最后用Canodraw 4.5作圖,直觀展示相關(guān)性結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 MCR-1基因的檢出及空間分布特征

污水廠各點(diǎn)位均檢出 MCR-1(圖 2A),在曝氣沉砂池中豐度高達(dá) 8.64×1011copies/L,而在CAST生化池和MSBR生化池中顯著降低,分別為 5.89×1010和 2.93×1010copies/L,在曝氣生物流化池混合液中(ABFT)濃度進(jìn)一步降低為9.31×109copies/L.隨后開(kāi)始呈上升趨勢(shì),最終出水中濃度為 1.42×1011copies/L.污水處理工藝對(duì)MCR-1去除率為83.6%.

由于污水廠中 MCR-1研究很少,以其他抗性基因?qū)Ρ?MCR-1的去除效果.調(diào)研發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)工藝對(duì)四環(huán)素抗性基因的去除率大多為30%～90%[22-23].另外Munir等[24]研究了美國(guó) 5個(gè)污水廠對(duì)四環(huán)素抗性基因和磺胺類(lèi)抗性基因的去除,發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)污水廠去除率在 2.37～ 4.56log(＞99.6%),MBR 工藝去除率可達(dá) 2.57～ 7.06log(＞99.7%).課題組此前針對(duì)另一城市污水廠的研究表明,污水處理工藝對(duì) 6種抗性基因的去除率(包括ampC、ereA、aacC1、sulI、tetA和vanA)平均在 2.1log(即 99.2%)[8].可發(fā)現(xiàn)本污水廠對(duì)MCR-1的去除效果偏低,這一方面可能是因?yàn)椴煌芯恐形鬯幚砉に囉兴顒e,另一方面也表明污水處理工藝無(wú)法良好的去除該基因,出水仍存留較高濃度.此外,剩余污泥中 MCR-1濃度遠(yuǎn)高于出水,達(dá) 2.88×1012copies/L.相似的結(jié)果也被前人證實(shí),如 He等[25]研究發(fā)現(xiàn)污水處理廠中抗性基因主要存在于污泥中.這可能是因?yàn)镸CR-1主要存在于胞內(nèi),而剩余污泥生物量很高.這也意味著出水中 MCR-1濃度的降低主要是由于大部分微生物轉(zhuǎn)移至污泥中.

圖2 不同取樣點(diǎn)MCR-1豐度和相對(duì)豐度Fig.2 MCR-1abundance (A) and relative abundance (B)in various sampling sites

從圖 2B MCR-1的相對(duì)豐度變化發(fā)現(xiàn),除少數(shù)點(diǎn)位,MCR-1相對(duì)豐度并無(wú)顯著下降,最終出水中相比進(jìn)水甚至顯著升高,達(dá) 6.55×10-5.進(jìn)一步表明污水處理工藝不能有效控制 MCR-1.這可能有兩方面原因所致.一方面MCR-1攜帶菌相比于一般細(xì)菌更難被去除,致使相對(duì)豐度升高;另一方面可能部分MCR-1基因以胞外的形式存在,而污水處理工藝不能對(duì)其很好的控制.對(duì)比MCR-1經(jīng)出水和剩余污泥排放的總量,發(fā)現(xiàn)盡管污泥中MCR-1濃度更高,經(jīng)出水排放的抗性基因(97.9%)遠(yuǎn)高于剩余污泥中基因總量(2.1%),這主要是由于污水處理廠出水量遠(yuǎn)大于剩余污泥量.顯而易見(jiàn),大量的 MCR-1將通過(guò)出水排放至長(zhǎng)江,造成抗藥性向地表水的傳播;而污泥中高濃度的MCR-1抗性基因,按照目前主流的填埋或堆肥處置,均可能造成抗藥性進(jìn)一步傳播的風(fēng)險(xiǎn).

2.2 粘菌素耐藥菌的分布特征

考察耐粘菌素細(xì)菌豐度(圖3)發(fā)現(xiàn),其在各處理單元中都存在,意味著可能攜帶 MCR-1.沉砂池(INF)中細(xì)菌濃度最高,達(dá) 3.94×105CFU/mL,這說(shuō)明污水廠耐粘菌素細(xì)菌主要是源廢水的輸入,在CAST池與MSBR池中有所降低,但依然維持在較高水平,分別為1.62×105和1.28×105CFU/mL,曝氣生物流化池(ABFT)中則顯著下降為 2.02×103CFU/mL,最終出水中繼續(xù)降低至 53CFU/mL;和 MCR-1分布類(lèi)似,剩余污泥中細(xì)菌濃度遠(yuǎn)高于出水,達(dá) 2.04×105CFU/mL.污水處理工藝對(duì)耐粘菌素的細(xì)菌去除率高達(dá)99.98%.

耐粘菌素細(xì)菌豐度隨污水處理流程逐步下降,與 MCR-1先下降后增長(zhǎng)的趨勢(shì)不相吻合,可能是因?yàn)椴⒎撬蠱CR-1攜帶菌都是可培養(yǎng)的.事實(shí)上,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,環(huán)境中90%以上的細(xì)菌均為不可培養(yǎng)[26].另外,MCR-1基因可能不全存在于胞內(nèi),有相當(dāng)一部分基因游離于細(xì)胞外,這從兩者很低的相關(guān)性(R=0.06142)也可得到證實(shí).

圖3 不同取樣點(diǎn)耐粘菌素細(xì)菌的豐度Fig.3 Abundance of colistin resistant bacteria in various sampling sites

2.3 MCR-1分布特征與水質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性

圖4 MCR-1絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度以及 16SrDNA豐度受水質(zhì)指標(biāo)的影響的RDA分析Fig.4 The RDA analysis about the abundance and relative abundance of MCR-1and the abundance of 16S rDNA in functions of wastewater quality parameters

對(duì)水質(zhì)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)(圖 4A)發(fā)現(xiàn),進(jìn)水和MSBR池中氨氮濃度較高,分別為 4.6mg/L和4.2mg/L.而 MSBR池中 COD和總氮分別高達(dá)1958.2mg/L和 281.9mg/L.曝氣生物流化池混合液和澄清池出水及最終出水中亞硝酸鹽氮含量較高,分別為2.6、2.8和2.8mg/L.

從圖4B中可知MCR-1與氨氮豐度呈正相關(guān),即氨氮含量越高會(huì)導(dǎo)致出水中 MCR-1含量升高,而和其他指標(biāo)間幾乎不相關(guān).氨氮隨處理流程呈逐漸降低的趨勢(shì),這可能表明 MCR-1攜帶菌對(duì)氨氮需求較為明顯,比如硝化細(xì)菌等.另外,16S rDNA和硝酸鹽氮、COD、氨氮、總氮均呈正相關(guān).表明城市污水中細(xì)菌以好氧有機(jī)物降解菌為主,表現(xiàn)為污染物濃度越高,細(xì)菌含量越多.相比之下,MCR-1相對(duì)豐度與亞硝酸鹽氮和氨氮幾乎不相關(guān),而與硝酸鹽氮、COD、總氮呈負(fù)相關(guān),意味著 MCR-1攜帶菌可能很多是自養(yǎng)細(xì)菌.上述相關(guān)性分析表明在以好氧有機(jī)物降解菌為主的污水處理廠MCR-1攜帶菌并非優(yōu)勢(shì)菌種,強(qiáng)化氨氮的去除可能有利于MCR-1的去除.

2.4 MCR-1攜帶菌的耐藥特征

污水廠不同點(diǎn)位MCR-1攜帶菌抑菌圈隨抗生素濃度變化如圖5所示.可以發(fā)現(xiàn),沉砂池出水、澄清池出水、消毒出水和剩余污泥中大多數(shù)細(xì)菌隨粘菌素濃度的提高抑菌圈直徑增大,表明對(duì)高濃度抗生素的耐受能力下降,而CAST混合液、MSBR混合液和 ABFT混合液中大部分細(xì)菌能耐受相當(dāng)高濃度的抗生素,抑菌圈直徑并不隨抗生素濃度提高而變化,意味著耐高濃度粘菌素能力較強(qiáng).

由圖6中各點(diǎn)位MCR-1攜帶菌抑菌圈直徑平均值發(fā)現(xiàn),進(jìn)水中細(xì)菌耐粘菌素能力較弱,在300mg/L粘菌素濃度下,抑菌圈直徑可達(dá)1.039cm,而CAST池、MSBR池和ABFT池中細(xì)菌耐粘菌素能力顯著提高,抑菌圈直徑縮小至 0.843cm,至出水中抑菌圈直徑為0.821cm,其耐粘菌素能力顯著高于進(jìn)水.表明盡管MCR-1及粘菌素耐藥菌豐度隨處理流程降低,但污水處理工藝使剩余的MCR-1攜帶菌耐粘菌素能力顯著提高,耐藥性風(fēng)險(xiǎn)反而增強(qiáng).相比之下,剩余污泥中細(xì)菌耐藥能力最低,抑菌圈直徑達(dá)0.97cm.

圖5 不同點(diǎn)位MCR-1攜帶菌抑菌圈直徑隨粘菌素濃度的變化Fig.5 The inhibition zone diameter of MCR-1hosting bacteria isolated from various sampling sites in function of the colistin concentration

圖6 各點(diǎn)位MCR-1攜帶菌抑菌圈直徑平均值隨粘菌素濃度的變化Fig.6 The average inhibition zone diameter of MCR-1hosting bacteria isolated from various sampling sites in function of the colistin concentration

CAST池、MSBR池和曝氣生物流化池(ABFT)為生物處理的主要單元,曝氣使得反應(yīng)池內(nèi)混合條件良好,同時(shí)水中存在大量微生物,提供了豐富的 MCR-1潛在受體,可能造成了基因的廣泛轉(zhuǎn)移,從而極大提高了細(xì)菌攜帶抗性基因的概率.另外,污泥中細(xì)菌耐藥能力較低,可能表明污泥沉淀過(guò)程“選擇性地”沉淀了耐藥性能較低的細(xì)菌而保留少數(shù)耐藥性能較高的細(xì)菌.這可能是由于不同的MCR-1攜帶菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)或吸附性能等方面的差異造成,這種差異也側(cè)面反映了MCR-1在不同細(xì)菌中的傳播能力,即出水中MCR-1攜帶菌傳播能力更強(qiáng).無(wú)論如何,研究結(jié)果表明出水和剩余污泥中MCR-1都具有顯著的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn),出水中 MCR-1攜帶菌數(shù)量較少而耐藥性能和傳播能力很強(qiáng),污泥中耐藥性能變?nèi)醯珴舛却蟠筇岣?

3 結(jié)論

污水處理工藝對(duì)MCR-1及粘菌素耐藥菌的去除率分別為83.6%和99.98%,但出水中MCR-1濃度仍達(dá) 1.42×1011copies/L,剩余污泥中 MCR-1濃度達(dá)2.88×1012copies/L,且處理后MCR-1相對(duì)豐度提高.出水是污水廠 MCR-1的主要排放方式,占總排放量的97.9%.MCR-1豐度與氨氮濃度呈正相關(guān),與其他水質(zhì)指標(biāo)無(wú)明顯相關(guān),而MCR-1相對(duì)豐度與COD、總氮和硝酸鹽含量呈負(fù)相關(guān).曝氣池(CAST、MSBR)和曝氣生物流化池(ABFT)中 MCR-1攜帶菌可耐受較高濃度粘菌素,且污水處理使出水中 MCR-1攜帶菌耐粘菌素能力顯著提高,存在較高的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).

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