HBV患者血清miRNA-122、IL-12、IL-4的水平變化及其意義

王艷瑛，魯曉娟

(駐馬店市中心醫院普外二科，河南 駐馬店 463000)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是肝臟疾病主要病因之一。HBV感染呈全球分布，與肝硬化及肝癌的關系密切，是世界范圍內重要的公共健康問題，全球人口的30%有血清學證據證實現癥或既往感染HBV[1]。micro RNA(miRNA)是一類內源性非編碼RNA，它參與癌癥發生發展過程中多個通路的調控[2]。研究表明，mi RNA-122在HBV感染中起著重要的抑制作用，它可能成為新的HBV感染診斷和預后的重要生物標記以及治療靶點[3]。 此外，一些細胞因子（IL-2，IL-4）等在慢性乙型肝炎發病機制及治療中的作用研究越來越受到人們的關注[4]。本研究探討乙型肝炎病毒（HBV）感染患者血清白細胞介素-12（IL-12）、白細胞介素-4（IL-4）及miRNA-122的水平變化及其意義，報告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取醫院確診的HBV感染患者126例（HBV組），另外選取健康體檢對象40例作為對照組，收集時間2014年1月至2017年1月。HBV組，男 62例、女 64例，年齡 28～75歲，平均49.6±18.7歲，其中慢性HBV攜帶者39例、慢性乙型肝炎患者54例、乙型肝炎肝硬化患者33例。對照組，男22例、女18例，年齡22～79歲，平均46.7±15.9歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 納入排除標準

1.2.1 納入標準 ⑴HBV感染的診斷及患者分組標準參考2010年《慢性乙型肝炎防治指南診斷標準》；⑵患者年齡范圍19～79歲；⑶對照組來源于本院體檢健康的自愿者；⑷本研究獲得研究對象的知情同意。

1.2.2 排除標準 ⑴肝臟腫瘤；⑵合并其他類型肝炎病毒感染；⑶HIV感染；⑷經過抗病毒治療。

1.3 miRNA-122檢測 抽取外周靜脈血2ml，置于EDTA抗凝管中，采用Trizol試劑盒（購自美國Invitrogen公司）提取血清總RNA，方法按照試劑盒說明書進行。Nanodrop2000型核酸測定儀上測定RNA濃度，選取U6作為內參基因，以cDNA為模板，采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（大連Takara公司）檢測血清miRNA-122水平。

1.4 IL-12、IL-4 患者于早上8點空腹采血5ml，3000r/min進行離心后提取上清，將上清液在-20℃的環境中保存，IL-12、IL-4使用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測，檢測試劑盒由上海嶸崴達實業有限公司提供，酶標儀選用Synergy H1全功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.5 HBeAg、HBV-DNA、ALT檢測 血清ALT用日本東芝TBA-2000FR全自動生化分析儀和配套試劑進行檢測，測定方法為酶速率法。HBV-DNA采用LightCycler熒光PCR檢測儀，試劑盒為中山大學達安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸擴增熒光檢測試劑盒，操作按照說明書進行。采用乙型肝炎診斷試劑盒進行乙肝病毒感染標志物HBeAg檢測。1.6統計學方法 統計軟件采用SPSS 16.0，采用均數±標準差（x±s）進行統計描述，組間比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關性分析法采用Pearson線性相關分析法；P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組的血清IL-12、IL-4及miRNA-122水平比較 慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的血清IL-12、miRNA-122水平均顯著的高于對照組（P＜0.05），慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者與對照組的血清IL-4水平差異均無統計學意義 （P＞0.05），慢性HBV攜帶者的血清IL-12、miRNA-122顯著高于慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）（表 1）。

2.2 各組的HBeAg、HBV-DNA、ALT水平比較 慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的HBeAg、lg HBVlog10HBV-DNA水平均顯著的高于對照組（P＜0.05），慢性乙型肝炎患者的HBeAg、ALT水平顯著的高于慢性HBV攜帶者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）（表 2）。

2.3 相關性分析 HBV感染患者IL-12、miRNA-122 與 HBeAg、lg log10 HBV-DNA、ALT 呈顯著的正相關性（P＜0.05），IL-4 與 HBeAg、lg log10 HBVDNA、ALT 無明顯的相關性（P＞0.05）（表 3）。

表1 各組的血清IL-12、IL-4及miRNA-122水平比較（x±s）

表2 各組的 HBeAg、HBV-DNA、ALT 水平比較（x±s）

表3 相關性分析

3 討論

乙型肝炎病毒(HBV）簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科[5]。近年來，乙型肝炎病毒 （HBV）感染是一個嚴重的公共衛生問題，在我國尤為突出。慢性HBV感染者可以劃分為慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、慢性HBV攜帶者及隱匿性慢性乙型肝炎[6]。目前，我國乙型肝炎的病原學診斷主要依據血清HBV感染標記物的檢測結果，主要反映人體對乙肝病毒的免疫反應狀態。但這種方法的缺點是血清HBV感染標記物組合模式較多，使結果難以判定，因此尋找可靠的檢測指標十分重要。

機體被HBV感染后，引起特異性免疫反應，促進疾病恢復。機體主要通過T淋巴細胞清除入侵的HBV病毒，T細胞既可以作為免疫效應細胞直接殺傷靶細胞，又可以作為免疫調節細胞調節免疫應答[7]。有研究報道稱，Th1/Th2細胞的比例失調可能是HBV感染慢性化的原因之一。白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）是由多種免疫細胞產生并作用于多種細胞的一類細胞因子，由Th1細胞分泌。IL-12可刺激活化型T細胞增殖，促進Th0細胞向Th1細胞分化，在抗腫瘤免疫及抗感染免疫中被人們寄予厚望[8]。本研究結果顯示，慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的血清IL-12水平均顯著的高于對照組 （P＜0.05），而且慢性HBV攜帶者的血清IL-12顯著的高于慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）；表明HBV感染患者的IL-12水平較健康人群顯著的增高，并且與患者肝功能、病毒復制、傳染性具有一定的關系。白細胞介素4（interleukin 4，IL-4)是Th2細胞分泌的細胞因子，在調節體液免疫和適應性免疫中起關鍵作用。Lu Y等[9]研究發現，在慢性乙型肝炎中，IL-4升高，體液免疫增強，與HBV持續感染有關。本研究結果顯示，慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者與對照組的血清IL-4水平差異均無統計學意義（P＞0.05），可能與HBV感染未能明顯影響Th2細胞合成和分泌IL-4有關，具體機制有待進一步研究。

micro RNA（mi RNA)是長度約 22 nt的內源性短鏈RNA，在體內可以通過促進靶向基因mRNA的降解，或抑制mRNA翻譯，從而導致靶基因水平下降。研究表明，miRNA參與多種腫瘤細胞的活動，在多種腫瘤中異常表達[10]。腫瘤組織中往往存在特異性miRNA表達量的變化。miRNA在肝癌組織中低表達，但在肝癌患者血清中含量則升高，其表達水平和預后有密切關系[11]。microRNA-122是肝臟的特異性 (miRNA)，占全部肝內miRNA的70%，研究表明miRNA-122能調控HBV的復制[12]。以往研究顯示，慢性乙肝病毒引起肝臟損傷會導致到miRNA-122的升高[13]。但是較少有研究指出其與患者肝功能之間的關系。本研究結果顯示，慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的血清miRNA-122水平均顯著的高于對照組 （P＜0.05），這與國內外研究結果相符合[14，15]。進一步研究發現，慢性HBV攜帶者的血清miRNA-122顯著的高于慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）；而慢性乙型肝炎患者的HBeAg、ALT水平顯著的高于慢性HBV攜帶者、乙型肝炎肝硬化患者 （P＜0.05）。說明血清miRNA-122的表達水平與肝臟損傷程度呈負相關，因此miRNA-122的表達水平有可能成為監控慢性HBV感染的血清學指標。

綜上所述，HBV感染患者的miRNA-122、IL-12水平較健康人群顯著的增高，并且與患者肝功能、病毒復制、傳染性具有一定的關系，因此miRNA-122、IL-12在HBV感染患者血清中的表達情況，對該病的早期診斷、治療和預后評估可能有重要意義，需進一步研究闡明其具體功能。

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