CLSI EP9-A3在兩種不同方法測定糖化血紅蛋白結(jié)果比對及偏倚評估中的應(yīng)用

胡軍紅，謝建紅，鄧灼斌，黃燕莉，曹證福，毛文杰

(佛岡縣人民醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn)511600)

糖化血紅蛋白(HbA1c)是人體血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖進(jìn)行非酶結(jié)合的產(chǎn)物，其反應(yīng)的是一段時(shí)間內(nèi)病人的血糖控制水平，是用來判斷糖尿病患者血糖控制效果的理想指標(biāo)。但在目前臨床應(yīng)用過程中，由于儀器不同、方法不同以及實(shí)驗(yàn)室的檢測能力不同，導(dǎo)致HbA1c檢測結(jié)果間仍有較大差異[1-3]，因此探討不同方法之間HbA1c結(jié)果的可比性顯得非常重要。我院之前的HbA1c一直是用深圳普門的高效液相色譜法(HPLC)方法進(jìn)行測定，由于只有一臺儀器，除了在儀器發(fā)生故障時(shí)會(huì)影響工作開展，還有碰到可疑的測定結(jié)果時(shí)，也無法用其他方法去驗(yàn)證，所以最近我們又準(zhǔn)備引進(jìn)寧波美康的免疫比濁法HbA1c測定試劑盒組建新的檢測系統(tǒng)，為了了解這兩套檢測系統(tǒng)測定HbA1c結(jié)果的可比性，我們根據(jù)2013年8月CLSI發(fā)布的EP9-A3《用患者樣本進(jìn)行方法學(xué)比對及偏移評估——批準(zhǔn)指南；第三版》文件[4]，對普門的高效液相色譜法(HPLC)和寧波美康的免疫比濁法這兩套HbA1c檢測系統(tǒng)測定HbA1c結(jié)果進(jìn)行了系統(tǒng)間的方法比對和偏移評估，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 全血樣本 收集40例本院住院及門診病人新鮮全血標(biāo)本，全血標(biāo)本采用乙二胺四乙酸二鉀鹽(EDTA-K2)抗凝，采樣后在2-6℃冰箱儲(chǔ)存，并在24h內(nèi)完成測定，標(biāo)本HbA1c濃度在測量線性范圍（3%-18%）內(nèi)均勻分布，其中在3.0%-6.7%濃度范圍內(nèi)樣本13例，在6.9%-9.9%濃度范圍內(nèi)樣本13個(gè)，在10%-18%濃度范圍內(nèi)樣本14例。

1.1.2 儀器與試劑 普門H9高效液相色譜儀及其配套試劑 (批號：H9V1700702)、校準(zhǔn)品 (批號：H9V1700702)、質(zhì) 控 品(批 號 ：H9V1700702)；日 立7600生化分析儀及美康HbA1c試劑 (批號：17031401)、校準(zhǔn)品(批號：17031401)和質(zhì)控品(Level l：170038；Level 2：171089)

1.2 方法

1.2.1 比對系統(tǒng) (1)普門H9高效液相色譜儀及其配套試劑組成的HbA1c測定系統(tǒng)為參比系統(tǒng)(X)，美康免疫比濁試劑與日立7600生化分析儀組成HbA1c測定系統(tǒng)為待評系統(tǒng)(Y)。

1.2.2 標(biāo)本測定 按照EP9-A3文件要求，收集的40例糖化血紅蛋白標(biāo)本分別用這兩套檢測系統(tǒng)隨機(jī)測定，每套系統(tǒng)對每份標(biāo)本進(jìn)行一次測定，并對結(jié)果進(jìn)行記錄。測定之前儀器已按相關(guān)要求進(jìn)行了校準(zhǔn)，當(dāng)天的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)也在控制范圍內(nèi)。如發(fā)現(xiàn)離群值，則應(yīng)舍棄其結(jié)果并補(bǔ)充濃度水平相近的標(biāo)本再進(jìn)行測定。

1.2.3 離群值檢查 按照EP9-A3文件要求，用目測散點(diǎn)圖和ESD方法對40例標(biāo)本的HbA1c測定結(jié)果進(jìn)行離群值檢查。

1.2.4 結(jié)果比對與偏倚評估 繪制差值偏差圖、百分比差值偏差圖、差值排序偏差圖和百分比差值排序偏差圖和散點(diǎn)圖，根據(jù)不同檢測系統(tǒng)間測定結(jié)果的散點(diǎn)圖和4種偏差圖的具體特征，選擇最適合的回歸模型進(jìn)行擬合，并計(jì)算醫(yī)學(xué)決定水平處的比例偏移及偏移95%的CI，以偏移值在95%CI范圍內(nèi)和比例偏移≤1/2允許總誤差(±4%)作為它的可接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件及方法 采用微軟公司Excel 2010和SPSS 19.0軟件處理測定數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用（x±s）表示，通過分析測定數(shù)據(jù)的4種偏差圖和散點(diǎn)圖的具體特征，選取最合適的回歸模型進(jìn)行計(jì)算，顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 離群值檢驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 目測分析：從圖1的散點(diǎn)圖可以發(fā)現(xiàn)，兩種不同系統(tǒng)檢測的40例標(biāo)本HbA1c結(jié)果有非常好的相關(guān)性（R2=0.9982），目測分析沒有發(fā)現(xiàn)離群值。

2.1.2 ESD法檢驗(yàn)：根據(jù)廣義極端學(xué)生化偏差ESD計(jì)算公式：ESD=max(|dj-d|)/SD，第31號樣本差值最大，經(jīng)計(jì)算，ESDmax=2.35，根據(jù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的樣本量n=40，設(shè)定α=0.05的情況下，查詢ESD臨界值表，λ=3.04，故當(dāng) i=1 時(shí)，ESD1<λ1，此 2 種方法 HbA1c檢測結(jié)果具有非常好的相關(guān)性，ESD法檢驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)離群值。

2.2 結(jié)果比對與偏倚評估

2.2.1 方法間差值的偏差圖特征分析及相應(yīng)的回歸模型選擇：按照EP9-A3文件要求對此40份血清標(biāo)本的HbA1c結(jié)果繪制數(shù)值偏差圖 （圖2A）、百分比差值偏差圖（圖2B）、差值排序偏差圖(圖2C)、百分比差值排序偏差圖（圖2D）等。普門高效液相色譜法與美康免疫比濁法比較，兩者差值變化為恒定值，兩種方法測定結(jié)果總體呈現(xiàn)線性變化趨勢，相關(guān)系數(shù)R2≥0.95，故選擇OLR回歸分析模型進(jìn)行擬合。

圖1 2種不同方法測定HbA1c結(jié)果散點(diǎn)圖

2.2.2 回歸方程選擇及偏移評估結(jié)果：EP9-A3雖然提供了 4種模型進(jìn)行回歸分析（OLR、WLS、Deming、Passing-Baklok），但根據(jù)這2種方法測定結(jié)果的上述4張偏差圖和散點(diǎn)圖表現(xiàn)出來的數(shù)值變化特點(diǎn)-各數(shù)據(jù)點(diǎn)差值變化相對一致（恒定SD），相關(guān)系數(shù)R2≥0.95，我們選取OLR作為最佳回歸模型進(jìn)行擬合，其回歸方程為Y=1.0084X+0.0018。將10%、16%這兩個(gè)HbA1c醫(yī)學(xué)決定水平值分別代入擬合方程，其在醫(yī)學(xué)決定水平處的偏移值分別為0.086%和0.136%，均在偏移的95%的CI范圍內(nèi)，其比例偏移分別為0.85%、0.84%，均小于±4%的可接受標(biāo)準(zhǔn)。(見表1)。

3 討論

表1 HbA1c比對OLR回歸模型在醫(yī)學(xué)決定水平處的偏移結(jié)果

圖2 普門高效液相色譜法與美康免疫比濁法測定HbA1c差值偏差圖與排序偏差圖

近年來，HbA1c在糖尿病的篩查、診斷和治療中及糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的診斷和治療中發(fā)揮著非常重要的作用[5-8]，所以為臨床提供準(zhǔn)確的HbA1c結(jié)果顯得尤為重要。由于目前糖化血紅蛋白測定方法有很多種，如有高效液相色譜法、電泳法、免疫比濁法、親和層析法及酶法等方法，其測定原理也各異[9]，所以儀器的不同、方法學(xué)的不同及實(shí)驗(yàn)室人員檢測能力的不同會(huì)導(dǎo)致HbA1c檢測結(jié)果間存在較大差異[10-12]。因?yàn)楣ぷ鞯男枰緦?shí)驗(yàn)室在原普門HPLC法測定HbA1c的基礎(chǔ)上，準(zhǔn)備引進(jìn)美康免疫比濁法試劑與日立7600組成新的HbA1c測定系統(tǒng)，根據(jù)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則[13]要求，實(shí)驗(yàn)室使用兩套及以上檢測系統(tǒng)檢測同一項(xiàng)目時(shí)，應(yīng)對其檢測結(jié)果的一致性進(jìn)行驗(yàn)證。由于普門HPLC法HbA1c儀器已在實(shí)驗(yàn)室使用較長時(shí)間，其室間質(zhì)評成績優(yōu)秀，CV值<2%，故以此作為參比系統(tǒng)，新引進(jìn)美康免疫比濁法試劑盒和日立7600組成的HbA1c測定系統(tǒng)作為待評系統(tǒng)與其進(jìn)行結(jié)果比對和偏倚評估分析。參考EP9-A3文件及其他相關(guān)論文[14，15]，我們繪制了這兩種檢測系統(tǒng)之間HbA1c測定值的散點(diǎn)圖，沒發(fā)現(xiàn)有明顯的離群結(jié)果，然后用ESD法檢驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)無離群值點(diǎn)。接下來通過分析兩種系統(tǒng)間的4種偏差圖(差值偏差圖、百分比差值偏差圖、差值排序偏差圖和百分比差值排序偏差圖)的變化特征，發(fā)現(xiàn)這兩種不同方法的測定HbA1c結(jié)果呈現(xiàn)線性變化趨勢，兩者差值總體呈現(xiàn)恒定SD變化，相關(guān)系數(shù)R2≥0.95，因此我們對這兩種方法間的比較分析選取了OLR回歸分析模型進(jìn)行擬合，其回歸方程為Y=1.0084X+0.0018。將HbA1c兩個(gè)醫(yī)學(xué)決定水平10%、16%分別代入回歸方程中，結(jié)果顯示，其兩個(gè)醫(yī)學(xué)決定水平處的偏移值分別為0.086%和0.136%，均在醫(yī)學(xué)決定水平偏移的95%CI范圍內(nèi)，其比例偏移值為0.85%、0.84%，均小于±4%的可接受標(biāo)準(zhǔn)，所以普門的高效液相色譜法與美康免疫比濁法這2種不同方法測定HbA1c的結(jié)果具有可比性，均能滿足臨床需求。

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